24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
查看: 2150  |  回复: 10
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

wzhgaochuan

新虫 (小有名气)

[求助] 玉米转基因植株的检测中遇到的问题

最近一直在做玉米转基因植株的检测,但是总也没有目的带。想知道是怎么做的,基因组有什么要求OD260: OD280为多少,多少纳克。具体的体系等等,我的引物最适合退火为53度。目的基因1400bp.
麻烦大家帮一下忙啊,急着要毕业,要是出不来结果会被延期啊~~·
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w2boluo

金虫 (小有名气)

引用回帖:
6楼: Originally posted by wzhgaochuan at 2011-08-12 17:31:49:
我的反应体系:即在25μL体系中,模板DNA50-160ng(3-8ul),1×PCR buffer,dNTPs62.5pmol/μL,Primers0.25pmol/μL,Taq DNA polymerase1.25U。反应程序为:94℃预变性10min;94℃变性50S,54℃退火40S,7 ...

模板是试剂盒提的还是ctab法提的?如果是后者,杂质含量一般不低,25ul体系里加这么多实在是多了。模板减少点试试,像这种浓度的,几个ng的模板已经足够了,个人倾向于使用0.5-1ul模板。pp5的计算值一般偏高,引物在20个碱基左右可以直接用2XAT个数+4XGC个数的经验公式估算,我一般是直接先用50度或者48度试试。酶体系也很关键,893bp用takara的extaq和rtaq扩增一般很不给力,我会直接用LA,楼上很多人说玉米基因组含量比较高,那变性温度我会用95度,然后扩不出来就用LA taq酶所附带的GC buffer,酱紫。
How about the future?
9楼2011-08-13 21:35:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 11 个回答

w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

wzhgaochuan(金币+2): 谢谢您的回答啦,受益匪浅,希望试验能出来。 2011-08-12 15:49:36
写的太不详细了。是自己做的转基因植株的验证,还是市面上买来的玉米面的转基因检测?不管哪种,都不该用1.4k的检测pcr,太长了,300-500还差不多。直接从叶片提基因组比较简单,用于做pcr模板的话,质量要求不是那么高。建议多了解一下转基因的插入序列,只选目的基因的一段用来做pcr,只要这一段是野生型玉米里面没有的就行。
How about the future?
2楼2011-08-12 09:31:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wzhgaochuan

新虫 (小有名气)

我的是自己的转基因材料检测,就是从叶片中提取的基因组,不过浓度不高30ng/ul。插入的目的基因全长2.4K。那应该怎么设计体系呢?还有退火温度。按照PP5中的Ta Opt值吗?谢谢了
3楼2011-08-12 10:49:26
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

选插入序列的一段用来作为靶片段,这个片段一般是玉米基因组中本身没有的。例如如果使用玉米的ubi启动子,就不能针对ubi启动子设计引物,而要根据ubi启动的后半段序列加上插入编码区(或RNAi茎环的茎区)前半段,约在400-600bp的靶片段设计引物。产物要避开诸如RNAi的茎环结构区。退火温度可以通过实验确定。
How about the future?
4楼2011-08-12 11:44:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 一志愿华中农微生物,288分,三年实验经历 +7 代fish 2026-04-09 7/350 2026-04-09 17:50 by lijunpoly
[考研] 269求调剂 +3 跪求收留。 2026-04-04 3/150 2026-04-09 17:49 by wp06
[考研] 268分085602化学工程调剂 +16 月照花林。 2026-04-09 16/800 2026-04-09 17:49 by hxwb99
[考研] 调剂 +12 JLLLLLLLLLL 2026-04-03 12/600 2026-04-09 16:14 by angeltong
[考研] 274求调剂 +5 山阿蔓 2026-04-07 5/250 2026-04-09 15:28 by 18828373951
[考研] 求助071001调剂!!! +7 黄守松 2026-04-05 8/400 2026-04-09 09:07 by 徐良白眉大侠
[考研] 生物学328分求调剂 +9 闪电kkl 2026-04-08 10/500 2026-04-08 21:42 by liuhuiying09
[考研] 本科211,293分请求调剂 +12 莲菜就是藕吧 2026-04-03 13/650 2026-04-08 20:30 by 背对大海出发
[考研] 347材料专硕求调剂 +18 zj8215216 2026-04-06 18/900 2026-04-08 16:27 by luoyongfeng
[考研] 一志愿南昌大学,085600,344分求调剂 +11 调剂上岸玘 2026-04-05 12/600 2026-04-08 16:17 by luoyongfeng
[考研] 284求调剂 +17 梵@@ 2026-04-06 17/850 2026-04-08 11:35 by 1shin_ichi
[考研] 319分085702安全工程求调剂 +6 rious 2026-04-05 6/300 2026-04-07 09:42 by jp9609
[考研] 考研调剂 +7 15615482637 2026-04-04 7/350 2026-04-06 22:56 by chenzhimin
[考研] 生物学求调剂 一志愿沪9,326分 +6 刘墨墨 2026-04-06 6/300 2026-04-06 19:36 by lijunpoly
[考研] 071000生物学调剂 +7 拉提桃 2026-04-06 7/350 2026-04-06 18:55 by 52305043001
[考研] 材料工程310专硕调剂 +14 捞捞我…. 2026-04-04 15/750 2026-04-06 14:18 by lqwchd
[考研] 296求调剂 +3 汪!?! 2026-04-05 5/250 2026-04-05 17:38 by 蓝云思雨
[考研] 309求调剂 +4 快乐的小白鸽 2026-04-04 5/250 2026-04-04 15:55 by cql1109
[考研] 考研调剂 +3 Draa 2026-04-03 3/150 2026-04-03 17:37 by hgwz7468
[考研] 338求调剂 +7 晟功? 2026-04-03 7/350 2026-04-03 16:46 by wxiongid
信息提示
请填处理意见