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knock

金虫 (小有名气)

[求助] PCR, southern 转基因植物阳性检测

事情是这样的,我用PCR检测转基因植株(T1代),总是只能看到少数几个弱弱的条带,没办法,那就矮子里面挑将军,每个株系挑一个条带稍微比较亮的做基因组大提,继续做SOUTHERN杂交,可就是杂不出来,阳性对照和以前的一个阳性植株(PCR条带很亮)可以杂出来。基因组提取是没有问题的,分光光度计检测浓度纯度都不错。我现在想问的是,基因是遗传丢失了还是怎么回事,若是丢失又为什么还有弱弱的带呢,若没丢失又杂不出来呢。PCR和SOUTHERN的灵敏度哪个更高一点,希望大家不吝赐教。已经在这事上耽搁一个月了,救命
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


knock(金币+2): 2011-05-14 15:55:49
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-05-14 19:44:42
1、PCR检测假阳性的情况比较多一些,建议多做几个重复。
2、Southern的酶切效果如何?上样量是多少?
3、我曾经做同位素Southern的灵敏度挺高的,不知道楼主是不是同位素的。基因组的质量没问题的话,操作上可以适当改变一些条件再试!
2楼2011-05-14 13:39:22
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knock

金虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 太极拳 at 2011-05-14 13:39:22:
1、PCR检测假阳性的情况比较多一些,建议多做几个重复。
2、Southern的酶切效果如何?上样量是多少?
3、我曾经做同位素Southern的灵敏度挺高的,不知道楼主是不是同位素的。基因组的质量没问题的话,操作上可以 ...

1 PCR重复了很多次了,结果都是一样。
2 SOUTHERN酶切电泳后弥散得很好,上样30ug
3 我们用的是地高辛的试剂盒,有一个以前的阳性株能检测出来(回收PCR产物双链的阳性和质粒阳性都能杂出来),所以SOUTHERN我感觉没问题。
3楼2011-05-14 15:55:40
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太极拳

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

knock(金币+4): 2011-05-14 19:27:35
地高辛的我也做过,也是只有CK+出了,别的都没出,后来就再也不做地高辛了。。。楼主可以尝试一下同位素
4楼2011-05-14 17:07:46
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henghengyouyou

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

knock(金币+4): 2011-05-26 22:33:13
T1代的条带应该扩增很亮的,你的探针可能被阳性对照弄走了!猜测!
5楼2011-05-16 20:10:12
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