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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌液PCR是阳性，却提不出来阳性质粒！求助
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461241086

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCR是阳性，却提不出来阳性质粒！求助

我的目的片段连接T载体后，菌液PCR可以扩增出目的基因，于是我把阳性菌的质粒提取出来再跑电泳，居然没有目的条带（T载体和目的基因共4kb）只有2500bp左右的带,谁能告诉我这是怎么回事？
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1楼 2011-10-24 21:39:17
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回帖置顶 ( 共有1个 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3, MolEPI+1): Good！同时根据楼主在20楼的反馈回复，经决定，在解决菌落PCR问题方面授予EPI一枚！ 2011-10-26 11:19:09
gyesang: 回帖置顶 2014-07-24 22:28:16
菌液或者菌落PCR不是不可靠，关键是看你怎么用。
如果直接在载体两端设计引物，或者用插入片段上面的两条引物，这样的假阳性会很高。最好的办法是一条引物在载体上（对于常用载体可以专门设计一条），另一条引物在插入片段上（可以用克隆时的引物），这样的PCR结果是很可靠的。
菌落PCR最大的优势是可以一次性筛选大量样品，可以作为第一次筛选。我的做法是在PCR管里面加3ul水，然后用枪头或者牙签挑一点转化出来的菌，放在里面搅动几下，作为模板。如果菌落很小或者长得很密，把菌挑到水里之后，我会再点到新的平板上backup一下。我一般一次P上28个（刚好1板胶），转化率再低，总有那么几个是阳性的。第一次P不出来的话我会再P上几十个。
菌落PCR验证之后，就可以挑取几个候选的菌落，接菌，提质粒，之后进行第二轮筛选以确证：酶切，或者测序。
正确使用菌落PCR，可以避免一次性提大量质粒，节省工作量。我觉得这个方法还是很好用的。
补充下：我做的菌落PCR，只是把PCR的预变性从普通的95℃/5 min改成了95℃/15 min，用于裂解菌体并预变性，其他的跟普通PCR一样，也没有用特殊的裂解液。

[ Last edited by 西瓜 on 2011-10-25 at 18:38 ]
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19楼2011-10-25 17:48:04
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普通回帖

547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-25 11:04:48
目的片段在宿主菌有相似片段？引物在宿主菌总DNA有相似扩增区？菌液PCR的引物没有使用一载体一插入片段的组合！？总之，很可能是假阳性。
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为什么
2楼2011-10-24 22:21:23
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清风寨

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-25 11:06:55
你这2500的条带是不是空的T载体啊 只是大小估算错了  做菌落PCR会更方便鉴定  可以多挑点阳性的结果提质粒
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冷风过心变热
3楼2011-10-25 08:44:36
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 同意！ 2011-10-25 11:07:09
这样不就确定是空载了吗    菌液PCR可信度不高的

你要么再跑个质粒和酶切后质粒的电泳看看
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hold住
4楼2011-10-25 09:14:42
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guojianping

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): yes！ 2011-10-25 11:07:33
本来菌液PCR不靠谱的。可能正好宿主菌有相似的片段。都不用验证了，直接重做吧。另外换引物，验证引物20+bp一般就没什么问题了，很特异，不太会假阳性
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5楼2011-10-25 09:25:40
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匿名

用户注销 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 我也觉得是假阳性 2011-10-25 17:32:17
本帖仅楼主可见
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6楼2011-10-25 09:27:12
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sfb1020

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

假阳性，PCR不可靠，我遇到过这种情况，能P出来，但是做酶切就不对。那就肯定没连上。重做
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7楼2011-10-25 11:14:56
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goodboy

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

一般菌液PCR不可靠，你换一下T载体上的通用引物克隆试试
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8楼2011-10-25 12:32:42
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eileen8519

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也遇到过几次这种情况，PCR能扩增出来，但是提质粒后酶切，却切不出目的基因片段，很可能是目的片段没有连接上去，PCR扩出来的是假阳性。
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9楼2011-10-25 14:01:15
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Petter_JDW

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 挺细心啊 2011-10-25 17:33:03
质粒是环状螺旋跑得比同等长度的线性片段快~你的2500bp的可能是连上的质粒，你可以酶切验证一下~
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10楼2011-10-25 15:19:28
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