24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 5356  |  回复: 31
本帖产生 1 个 MolEPI ,点击这里进行查看

iniceyezi

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

一定要做酶切验证才可以
11楼2011-10-25 15:54:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

461241086

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 清风寨 at 2011-10-25 08:44:36:
你这2500的条带是不是空的T载体啊 只是大小估算错了  做菌落PCR会更方便鉴定  可以多挑点阳性的结果提质粒

恩 菌落PCR是阳性的啊
12楼2011-10-25 16:28:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

461241086

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
11楼: Originally posted by iniceyezi at 2011-10-25 15:54:16:
一定要做酶切验证才可以

好的 我试试
13楼2011-10-25 16:28:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

461241086

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by zc10052157 at 2011-10-25 09:14:42:
这样不就确定是空载了吗    菌液PCR可信度不高的

你要么再跑个质粒和酶切后质粒的电泳看看

有道理 谢谢了
14楼2011-10-25 16:30:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

461241086

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
5楼: Originally posted by guojianping at 2011-10-25 09:25:40:
本来菌液PCR不靠谱的。可能正好宿主菌有相似的片段。都不用验证了,直接重做吧。另外换引物,验证引物20+bp一般就没什么问题了,很特异,不太会假阳性

谢谢
15楼2011-10-25 16:31:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

461241086

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
7楼: Originally posted by sfb1020 at 2011-10-25 11:14:56:
假阳性,PCR不可靠,我遇到过这种情况,能P出来,但是做酶切就不对。那就肯定没连上。重做

那就重做、。。。
16楼2011-10-25 16:33:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

461241086

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
9楼: Originally posted by eileen8519 at 2011-10-25 14:01:15:
我也遇到过几次这种情况,PCR能扩增出来,但是提质粒后酶切,却切不出目的基因片段,很可能是目的片段没有连接上去,PCR扩出来的是假阳性。

我没有做酶切 估计做了也是没有目的基因
17楼2011-10-25 17:24:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cdl007

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

菌液不可靠,提出质粒跑电泳也不可靠,金标准是测序,反正现在也不贵
18楼2011-10-25 17:28:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3, MolEPI+1): Good!同时根据楼主在20楼的反馈回复,经决定,在解决菌落PCR问题方面授予EPI一枚! 2011-10-26 11:19:09
gyesang: 回帖置顶 2014-07-24 22:28:16
菌液或者菌落PCR不是不可靠,关键是看你怎么用。
如果直接在载体两端设计引物,或者用插入片段上面的两条引物,这样的假阳性会很高。最好的办法是一条引物在载体上(对于常用载体可以专门设计一条),另一条引物在插入片段上(可以用克隆时的引物),这样的PCR结果是很可靠的。
菌落PCR最大的优势是可以一次性筛选大量样品,可以作为第一次筛选。我的做法是在PCR管里面加3ul水,然后用枪头或者牙签挑一点转化出来的菌,放在里面搅动几下,作为模板。如果菌落很小或者长得很密,把菌挑到水里之后,我会再点到新的平板上backup一下。我一般一次P上28个(刚好1板胶),转化率再低,总有那么几个是阳性的。第一次P不出来的话我会再P上几十个。
菌落PCR验证之后,就可以挑取几个候选的菌落,接菌,提质粒,之后进行第二轮筛选以确证:酶切,或者测序。
正确使用菌落PCR,可以避免一次性提大量质粒,节省工作量。我觉得这个方法还是很好用的。
补充下:我做的菌落PCR,只是把PCR的预变性从普通的95℃/5 min改成了95℃/15 min,用于裂解菌体并预变性,其他的跟普通PCR一样,也没有用特殊的裂解液。

[ Last edited by 西瓜 on 2011-10-25 at 18:38 ]
19楼2011-10-25 17:48:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

461241086

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
19楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-10-25 17:48:04:
菌液或者菌落PCR不是不可靠,关键是看你怎么用。
如果直接在载体两端设计引物,或者用插入片段上面的两条引物,这样的假阳性会很高。最好的办法是一条引物在载体上(对于常用载体 ...

非常感谢
20楼2011-10-25 18:09:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 461241086 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 302分 085601求调剂推荐 +8 zyx上岸! 2026-04-05 8/400 2026-04-05 12:21 by 无际的草原
[考研] 266分,一志愿电气工程,本科材料,求材料专业调剂 +5 哇呼哼呼哼 2026-04-02 6/300 2026-04-05 11:49 by 风雨无晴
[考研] 0817化学工程与技术求调剂,一志愿中海洋319 +12 lv945 2026-04-04 12/600 2026-04-05 11:12 by imissbao
[考研] 285求调剂 +10 哦呦呼o 2026-04-04 10/500 2026-04-05 11:12 by guoweigw
[考研] 353求调剂 +10 MayUxw1 2026-04-03 10/500 2026-04-05 09:23 by 无际的草原
[考研] 材料工程302分求调剂 +6 zyx上岸! 2026-04-04 6/300 2026-04-05 07:57 by qlm5820
[考研] 材料334求调剂 +15 Eecho# 2026-04-03 15/750 2026-04-04 23:05 by 无际的草原
[考研] 一志愿上海大学生物学346 +3 上海大学346调剂 2026-04-03 3/150 2026-04-04 20:20 by dongzh2009
[考研] 359求调剂 +7 hhhhaaaa$ 2026-04-04 7/350 2026-04-04 18:49 by imissbao
[考研] 0703求调剂 +6 zizimo 2026-03-31 6/300 2026-04-04 14:16 by 无际的草原
[考研] 学硕288调剂!!! +3 小王xw123 2026-04-03 3/150 2026-04-03 21:20 by 啵啵啵0119
[考研] 085801 总分275 本科新能源 求调剂 +19 bradoner 2026-04-01 23/1150 2026-04-03 10:07 by linyelide
[考研] 化学070300-总分378-求调剂 +5 挪椅子的泡泡糖 2026-04-02 5/250 2026-04-02 22:20 by ZXlzxl0425
[考研] 一志愿346上海大学生物学 +3 上海大学346调剂 2026-04-01 3/150 2026-04-02 08:36 by w虫虫123
[考研] 350求调剂 +7 阿佳~ 2026-03-31 7/350 2026-04-01 16:12 by yanflower7133
[考研] 求调剂 +4 DADA怪 2026-03-31 4/200 2026-04-01 14:30 by ZXlzxl0425
[考研] 358求调剂 +3 王向阳花 2026-03-31 3/150 2026-04-01 09:56 by zzchen2000
[考研] 085601 329分调剂 +6 yzsa12 2026-03-31 6/300 2026-03-31 15:23 by yanflower7133
[考研] 370求调剂 +3 080700调剂 2026-03-30 3/150 2026-03-31 01:09 by A_Zhe
[考研] 本科211总分289,08工学真心求调剂 +3 utopiaE 2026-03-30 3/150 2026-03-30 23:42 by ms629
信息提示
请填处理意见