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新虫 (初入文坛)

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[求助] 菌液PCR是阳性，却提不出来阳性质粒！求助

我的目的片段连接T载体后，菌液PCR可以扩增出目的基因，于是我把阳性菌的质粒提取出来再跑电泳，居然没有目的条带（T载体和目的基因共4kb）只有2500bp左右的带,谁能告诉我这是怎么回事？

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1楼 2011-10-24 21:39:17

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西瓜

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【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3, MolEPI+1): Good！同时根据楼主在20楼的反馈回复，经决定，在解决菌落PCR问题方面授予EPI一枚！ 2011-10-26 11:19:09
gyesang: 回帖置顶 2014-07-24 22:28:16

菌液或者菌落PCR不是不可靠，关键是看你怎么用。
如果直接在载体两端设计引物，或者用插入片段上面的两条引物，这样的假阳性会很高。最好的办法是一条引物在载体上（对于常用载体可以专门设计一条），另一条引物在插入片段上（可以用克隆时的引物），这样的PCR结果是很可靠的。
菌落PCR最大的优势是可以一次性筛选大量样品，可以作为第一次筛选。我的做法是在PCR管里面加3ul水，然后用枪头或者牙签挑一点转化出来的菌，放在里面搅动几下，作为模板。如果菌落很小或者长得很密，把菌挑到水里之后，我会再点到新的平板上backup一下。我一般一次P上28个（刚好1板胶），转化率再低，总有那么几个是阳性的。第一次P不出来的话我会再P上几十个。
菌落PCR验证之后，就可以挑取几个候选的菌落，接菌，提质粒，之后进行第二轮筛选以确证：酶切，或者测序。
正确使用菌落PCR，可以避免一次性提大量质粒，节省工作量。我觉得这个方法还是很好用的。
补充下：我做的菌落PCR，只是把PCR的预变性从普通的95℃/5 min改成了95℃/15 min，用于裂解菌体并预变性，其他的跟普通PCR一样，也没有用特殊的裂解液。

[ Last edited by 西瓜 on 2011-10-25 at 18:38 ]