应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌液PCR是阳性，却提不出来阳性质粒！求助
321/4返回列表1234下一页
查看: 6116  |  回复: 31
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看

461241086

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCR是阳性，却提不出来阳性质粒！求助

我的目的片段连接T载体后，菌液PCR可以扩增出目的基因，于是我把阳性菌的质粒提取出来再跑电泳，居然没有目的条带（T载体和目的基因共4kb）只有2500bp左右的带,谁能告诉我这是怎么回事？
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累 【分子生物】EPI帖 科研资源

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2011-10-24 21:39:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
wanhscn(金币+3, MolEPI+1): Good！同时根据楼主在20楼的反馈回复，经决定，在解决菌落PCR问题方面授予EPI一枚！ 2011-10-26 11:19:09
gyesang: 回帖置顶 2014-07-24 22:28:16
菌液或者菌落PCR不是不可靠，关键是看你怎么用。
如果直接在载体两端设计引物，或者用插入片段上面的两条引物，这样的假阳性会很高。最好的办法是一条引物在载体上（对于常用载体可以专门设计一条），另一条引物在插入片段上（可以用克隆时的引物），这样的PCR结果是很可靠的。
菌落PCR最大的优势是可以一次性筛选大量样品，可以作为第一次筛选。我的做法是在PCR管里面加3ul水，然后用枪头或者牙签挑一点转化出来的菌，放在里面搅动几下，作为模板。如果菌落很小或者长得很密，把菌挑到水里之后，我会再点到新的平板上backup一下。我一般一次P上28个（刚好1板胶），转化率再低，总有那么几个是阳性的。第一次P不出来的话我会再P上几十个。
菌落PCR验证之后，就可以挑取几个候选的菌落，接菌，提质粒，之后进行第二轮筛选以确证：酶切，或者测序。
正确使用菌落PCR，可以避免一次性提大量质粒，节省工作量。我觉得这个方法还是很好用的。
补充下：我做的菌落PCR，只是把PCR的预变性从普通的95℃/5 min改成了95℃/15 min，用于裂解菌体并预变性，其他的跟普通PCR一样，也没有用特殊的裂解液。

[ Last edited by 西瓜 on 2011-10-25 at 18:38 ]
赞一下(5人) 回复此楼
19楼2011-10-25 17:48:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-25 11:04:48
目的片段在宿主菌有相似片段？引物在宿主菌总DNA有相似扩增区？菌液PCR的引物没有使用一载体一插入片段的组合！？总之，很可能是假阳性。
赞一下(1人) 回复此楼
为什么
2楼2011-10-24 22:21:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

清风寨

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-25 11:06:55
你这2500的条带是不是空的T载体啊 只是大小估算错了  做菌落PCR会更方便鉴定  可以多挑点阳性的结果提质粒
赞一下(1人) 回复此楼
冷风过心变热
3楼2011-10-25 08:44:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 同意！ 2011-10-25 11:07:09
这样不就确定是空载了吗    菌液PCR可信度不高的

你要么再跑个质粒和酶切后质粒的电泳看看
赞一下(1人) 回复此楼
hold住
4楼2011-10-25 09:14:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

guojianping

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): yes！ 2011-10-25 11:07:33
本来菌液PCR不靠谱的。可能正好宿主菌有相似的片段。都不用验证了，直接重做吧。另外换引物，验证引物20+bp一般就没什么问题了，很特异，不太会假阳性
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2011-10-25 09:25:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

匿名

用户注销 (正式写手)
★
西瓜(金币+1): 我也觉得是假阳性 2011-10-25 17:32:17
本帖仅楼主可见
赞一下
6楼2011-10-25 09:27:12
已阅   申请MolEPI   回复此楼   编辑   查看我的主页

sfb1020

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

假阳性，PCR不可靠，我遇到过这种情况，能P出来，但是做酶切就不对。那就肯定没连上。重做
赞一下 回复此楼
7楼2011-10-25 11:14:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

goodboy

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

一般菌液PCR不可靠，你换一下T载体上的通用引物克隆试试
赞一下 回复此楼
8楼2011-10-25 12:32:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

eileen8519

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我也遇到过几次这种情况，PCR能扩增出来，但是提质粒后酶切，却切不出目的基因片段，很可能是目的片段没有连接上去，PCR扩出来的是假阳性。
赞一下 回复此楼
9楼2011-10-25 14:01:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Petter_JDW

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
西瓜(金币+1): 挺细心啊 2011-10-25 17:33:03
质粒是环状螺旋跑得比同等长度的线性片段快~你的2500bp的可能是连上的质粒，你可以酶切验证一下~
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2011-10-25 15:19:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 461241086 的主题更新
321/4返回列表1234下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[有机交流] OpenAI又攻克数学难题了，离AI做有机合成还有多远？ +8 wangyl_123 2026-10-10 12/600 2026-10-13 20:40 by Merryya
[硕博家园] 极限拉扯，如何抉择 +9 Isak0320 2026-10-12 13/650 2026-10-13 11:57 by Isak0320
[教师之家] 课题组会帮你通过考核么？ +4 好运来～9527 2026-10-10 7/350 2026-10-13 08:41 by xli1984
[基金申请] 入职后第一次管课题组的专利缴费，对账才发现官费比别人多掏了一倍 +6 13108017953 2026-10-08 6/300 2026-10-12 20:07 by w3w3y3
[公派出国] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:34 by XQNyDCa1Tk5n
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[公派出国] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:26 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 9/450 2026-10-11 22:15 by XQNyDCa1Tk5n
[考博] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 22:11 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI文章，我:8O5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 22:06 by XQNyDCa1Tk5n
[教师之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 (EPI+-1)(金币-50) +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 10/500 2026-10-11 14:25 by VOMexwnDzOFZ
[教师之家] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 (EPI+-1)(金币-50) +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 14:05 by VOMexwnDzOFZ
[考研] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:51 by VOMexwnDzOFZ
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 8/400 2026-10-11 13:45 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +3 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:54 by VOMexwnDzOFZ
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.5.4,科目齐全,可+急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 7/350 2026-10-11 10:34 by VOMexwnDzOFZ
[考博] 招收博士生一名 +3 mandolin 2026-10-10 3/150 2026-10-11 10:21 by 不是山谷！
[公派出国] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 qR2AdCWTVtkw 2026-10-09 4/200 2026-10-11 03:14 by M0zrYVSAnxpE
[有机交流] 各位大佬，路线设计求助 +6 zapen 2026-10-08 8/400 2026-10-10 15:59 by zapen
[有机交流] 我应该选哪条合成路线让实验成功率高一些？ +5 jing816y 2026-10-08 9/450 2026-10-10 09:05 by zapen
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭