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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌液PCR是阳性，却提不出来阳性质粒！求助
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380218013

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励交流 2011-10-26 11:19:43
菌液PCR可信度很差的，你可以提取质粒之后，酶切鉴定一下啊。还有就是你质粒提取的浓度是不是还可以？
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好好生活，努力赚钱
21楼2011-10-25 19:24:38
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lingorling

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-26 11:19:37
我前一段时间也遇到了和你差不多的情况，我做的菌落PCR鉴定为阳性，结果挑取阳性菌落在LB液体培养基中就是不长，而且我的抗生素也没有加错。折腾了几天之后，最后换了瓶新的LB就要出来了，也不知道究竟是为什么
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22楼2011-10-26 10:33:01
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hqwzj1987
23楼2011-10-26 11:03:06
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youngker918

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

质粒有超螺旋状态的，4Kb的超螺旋质粒跑的时间如果长点，出来的bp数也差不多只有2.5Kb的，不信楼主再对提出来的质粒酶切看看
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天才就怕不够天才，坏又不够坏，天天都想离开，却不知何处才能换骨脱胎
24楼2011-10-26 16:22:27
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麻花13

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
很可能是假阳性，涂布在平板上的目的基因被带到培养基中，然后就被pcr所察觉，建议设计这样一段引物，即原来目的基因的3'端引物+目的基因上游质粒上的一段序列作为5'端，这样只有被装载入载体的目的基因才能被PCR所检测
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25楼2012-03-06 10:28:34
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xjtu0025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我觉得T载体就别用菌落PCR了,一来是阳性率高,二来是本身你做克隆的话,最后都是要大范围扩增,然后酶切胶回收的..何必折腾呢..干脆多摇几个,切一下..值得注意的是,如果你的目的片段很小的话,例如300bp一下,起码要切5ugT质粒吧..不然你跑胶是真的只能看到T载体,看不到目的片段然后以为是假阳性...
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26楼2013-05-24 19:28:05
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Renavatio

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你提质粒直接电泳的话，肯定条带大小要比4k要小，因为质粒处于超螺旋形态比较多，然后你最好做个单酶切看哈，单酶切出来大小估计就是4k左右了。我提取的3k的质粒直接跑电泳条带就只有1.5kb左右了，这个很正常。
我经常使用菌落PCR来检查是否插入目的条带，很好用的，目前还没看见PCR能扩增出来，但是空载的情况
祝顺利！
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Undefined！
27楼2013-05-24 23:45:44
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a86411736

新虫 (初入文坛)
亲。我现在也遇到了这个问题，请问你找到是什么问题了么？问题解决了吗？急急急！！！
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28楼2014-09-26 10:21:49
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天地一微尘

铁杆木虫 (小有名气)
酶切后再跑电泳检测一下，有无目的基因片段。
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29楼2014-09-26 13:35:55
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豆瓣绿绿吖

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
25楼: Originally posted by 麻花13 at 2012-03-06 10:28:34
很可能是假阳性，涂布在平板上的目的基因被带到培养基中，然后就被pcr所察觉，建议设计这样一段引物，即原来目的基因的3'端引物+目的基因上游质粒上的一段序列作为5'端，这样只有被装载入载体的目的基因才能被PCR所 ...

可以教下我吗？新设计的引物是不是质粒引物的3'端的后一部分和引物的5‘端的前一部分？这个方法可行吗？
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30楼2017-12-15 13:48:01
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