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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 菌液PCR是阳性，却提不出来阳性质粒！求助
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461241086

新虫 (初入文坛)

[求助] 菌液PCR是阳性，却提不出来阳性质粒！求助

我的目的片段连接T载体后，菌液PCR可以扩增出目的基因，于是我把阳性菌的质粒提取出来再跑电泳，居然没有目的条带（T载体和目的基因共4kb）只有2500bp左右的带,谁能告诉我这是怎么回事？
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1楼 2011-10-24 21:39:17
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Renavatio

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

你提质粒直接电泳的话，肯定条带大小要比4k要小，因为质粒处于超螺旋形态比较多，然后你最好做个单酶切看哈，单酶切出来大小估计就是4k左右了。我提取的3k的质粒直接跑电泳条带就只有1.5kb左右了，这个很正常。
我经常使用菌落PCR来检查是否插入目的条带，很好用的，目前还没看见PCR能扩增出来，但是空载的情况
祝顺利！
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Undefined！
27楼2013-05-24 23:45:44
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-25 11:04:48
目的片段在宿主菌有相似片段？引物在宿主菌总DNA有相似扩增区？菌液PCR的引物没有使用一载体一插入片段的组合！？总之，很可能是假阳性。
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为什么
2楼2011-10-24 22:21:23
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清风寨

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助！ 2011-10-25 11:06:55
你这2500的条带是不是空的T载体啊 只是大小估算错了  做菌落PCR会更方便鉴定  可以多挑点阳性的结果提质粒
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冷风过心变热
3楼2011-10-25 08:44:36
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zc10052157

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 同意！ 2011-10-25 11:07:09
这样不就确定是空载了吗    菌液PCR可信度不高的

你要么再跑个质粒和酶切后质粒的电泳看看
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hold住
4楼2011-10-25 09:14:42
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