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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 玉米转基因植株的检测中遇到的问题
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wzhgaochuan

新虫 (小有名气)

[求助] 玉米转基因植株的检测中遇到的问题

最近一直在做玉米转基因植株的检测，但是总也没有目的带。想知道是怎么做的，基因组有什么要求OD260: OD280为多少，多少纳克。具体的体系等等，我的引物最适合退火为53度。目的基因1400bp.
麻烦大家帮一下忙啊，急着要毕业，要是出不来结果会被延期啊~~·
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1楼 2011-08-11 23:11:53
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

wzhgaochuan(金币+2): 谢谢您的回答啦，受益匪浅，希望试验能出来。 2011-08-12 15:49:36
写的太不详细了。是自己做的转基因植株的验证，还是市面上买来的玉米面的转基因检测？不管哪种，都不该用1.4k的检测pcr，太长了，300-500还差不多。直接从叶片提基因组比较简单，用于做pcr模板的话，质量要求不是那么高。建议多了解一下转基因的插入序列，只选目的基因的一段用来做pcr，只要这一段是野生型玉米里面没有的就行。
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How about the future？
2楼2011-08-12 09:31:02
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wzhgaochuan

新虫 (小有名气)
我的是自己的转基因材料检测，就是从叶片中提取的基因组，不过浓度不高30ng/ul。插入的目的基因全长2.4K。那应该怎么设计体系呢？还有退火温度。按照PP5中的Ta Opt值吗？谢谢了
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3楼2011-08-12 10:49:26
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

选插入序列的一段用来作为靶片段，这个片段一般是玉米基因组中本身没有的。例如如果使用玉米的ubi启动子，就不能针对ubi启动子设计引物，而要根据ubi启动的后半段序列加上插入编码区（或RNAi茎环的茎区）前半段，约在400-600bp的靶片段设计引物。产物要避开诸如RNAi的茎环结构区。退火温度可以通过实验确定。
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How about the future？
4楼2011-08-12 11:44:49
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邓远洪dyh

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

DNA的OD260:OD280在1.6到1.8之间为正常，高于这个值说明有RNA污染，低于这个值说明有蛋白质，酚类的污染。转基因的验证一般可以通过目的基因的PCR检测、southern杂交等进行检测。一般一个OD260相当于0.5微克每微升DNA。
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5楼2011-08-12 15:05:47
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wzhgaochuan

新虫 (小有名气)
我的反应体系：即在25μL体系中，模板DNA50-160ng（3-8ul），1×PCR buffer，dNTPs62．5pmol／μL，Primers0．25pmol／μL，Taq DNA polymerase1.25U。反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性50S，54℃退火40S，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。也试过降落PCR.61-51℃各一个循环，最后在55℃变性24个循环。最后也是没有目的条带。PP5上引物退火温度为Tm [°C]  57.8  和58.7，产物的 Ta Opt [°C] 为 54.3。目的带为893bp
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6楼2011-08-12 17:31:49
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zltj2008

铜虫 (小有名气)
恩 模板浓度我觉得可以不用加这么多  20ng左右 如果有的话，应该足可以扩的出来，多的话，效果反而不好。而且玉米基因组本身的GC含量就挺高的 挺不好鉴定的  多试几对引物看看
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7楼2011-08-13 15:03:47
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wzhgaochuan

新虫 (小有名气)
正在设计引物，目的片段400-600希望能扩出来吧。各路大神保佑
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8楼2011-08-13 17:15:10
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w2boluo

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wzhgaochuan at 2011-08-12 17:31:49:
我的反应体系：即在25μL体系中，模板DNA50-160ng（3-8ul），1×PCR buffer，dNTPs62．5pmol／μL，Primers0．25pmol／μL，Taq DNA polymerase1.25U。反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性50S，54℃退火40S，7 ...

模板是试剂盒提的还是ctab法提的？如果是后者，杂质含量一般不低，25ul体系里加这么多实在是多了。模板减少点试试，像这种浓度的，几个ng的模板已经足够了，个人倾向于使用0.5-1ul模板。pp5的计算值一般偏高，引物在20个碱基左右可以直接用2XAT个数+4XGC个数的经验公式估算，我一般是直接先用50度或者48度试试。酶体系也很关键，893bp用takara的extaq和rtaq扩增一般很不给力，我会直接用LA，楼上很多人说玉米基因组含量比较高，那变性温度我会用95度，然后扩不出来就用LA taq酶所附带的GC buffer，酱紫。
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How about the future？
9楼2011-08-13 21:35:09
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jianghy69

铜虫 (正式写手)
转基因的检测方法：southern、northern、RT PCR。
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10楼2012-04-25 11:04:44
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