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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 专业学科区 » 转基因 » 玉米转基因植株的检测中遇到的问题
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wzhgaochuan

新虫 (小有名气)

[求助] 玉米转基因植株的检测中遇到的问题

最近一直在做玉米转基因植株的检测，但是总也没有目的带。想知道是怎么做的，基因组有什么要求OD260: OD280为多少，多少纳克。具体的体系等等，我的引物最适合退火为53度。目的基因1400bp.
麻烦大家帮一下忙啊，急着要毕业，要是出不来结果会被延期啊~~·
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1楼 2011-08-11 23:11:53
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wzhgaochuan

新虫 (小有名气)
我的反应体系：即在25μL体系中，模板DNA50-160ng（3-8ul），1×PCR buffer，dNTPs62．5pmol／μL，Primers0．25pmol／μL，Taq DNA polymerase1.25U。反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性50S，54℃退火40S，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。也试过降落PCR.61-51℃各一个循环，最后在55℃变性24个循环。最后也是没有目的条带。PP5上引物退火温度为Tm [°C]  57.8  和58.7，产物的 Ta Opt [°C] 为 54.3。目的带为893bp
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6楼2011-08-12 17:31:49
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

wzhgaochuan(金币+2): 谢谢您的回答啦，受益匪浅，希望试验能出来。 2011-08-12 15:49:36
写的太不详细了。是自己做的转基因植株的验证，还是市面上买来的玉米面的转基因检测？不管哪种，都不该用1.4k的检测pcr，太长了，300-500还差不多。直接从叶片提基因组比较简单，用于做pcr模板的话，质量要求不是那么高。建议多了解一下转基因的插入序列，只选目的基因的一段用来做pcr，只要这一段是野生型玉米里面没有的就行。
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How about the future？
2楼2011-08-12 09:31:02
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wzhgaochuan

新虫 (小有名气)
我的是自己的转基因材料检测，就是从叶片中提取的基因组，不过浓度不高30ng/ul。插入的目的基因全长2.4K。那应该怎么设计体系呢？还有退火温度。按照PP5中的Ta Opt值吗？谢谢了
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3楼2011-08-12 10:49:26
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w2boluo

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

选插入序列的一段用来作为靶片段，这个片段一般是玉米基因组中本身没有的。例如如果使用玉米的ubi启动子，就不能针对ubi启动子设计引物，而要根据ubi启动的后半段序列加上插入编码区（或RNAi茎环的茎区）前半段，约在400-600bp的靶片段设计引物。产物要避开诸如RNAi的茎环结构区。退火温度可以通过实验确定。
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How about the future？
4楼2011-08-12 11:44:49
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