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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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weining1203

新虫 (小有名气)

[求助] rt-pcr图，请大神们帮助分析一下，急。。。谢谢。。。

大神们请帮忙分析一下RT-PCR电泳图，第一次做不明白什么原因。。。第一张是rna图，后两张是曝光度不同的pcr图。目的条带应该为850bp左右，引物为简并引物，图上最大的条带好像只有500bp，最小100bp，marker为DL2000，请好心虫友帮助分析一下，哪里出了问题，应该怎样设置pcr程序，引物和pcr条件都是文献上的。。。急。。。pcr程序：
1 94℃       4min

2 94℃       1min
3 49度     1min
4 72度     1min
32个循环
5 72度     10min
6 4度

rna






问题补充：rt-pcr试剂盒为宝生物 RNA PCR  KIT(AMV) Ver.3.0, 酶为takala EX Taq HS   兼并引物长度20bp

[ Last edited by weining1203 on 2012-4-18 at 11:25 ]
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1楼 2012-04-18 10:20:18
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cheng_xiao

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-19 13:50:37
从图上看出1、你的胶做的不好或者电泳条件不好，你的电泳条带歪了
               2、你的退火温度应根据你的引物单子自己设置，不应该抄文献上的
               3、目标片段不明确，说明你的引物设计不好，你应该比对一下，确定你的引物扩增片段准确
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我努力我奋斗我成功
2楼2012-04-18 20:14:59
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cheng_xiao at 2012-04-18 20:14:59:
从图上看出1、你的胶做的不好或者电泳条件不好，你的电泳条带歪了
               2、你的退火温度应根据你的引物单子自己设置，不应该抄文献上的
               3、目标片段不明确，说明你的引物设计不好，你 ...

谢谢您的回复 胶做的确实不好，第一次把marker跑成这样。。。 这个引物是通用引物，我想应该没问题吧。。。 下次想提高退火温度试一下。。。
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3楼2012-04-18 21:48:57
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wtyyyyy1988

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+1, 鼓励应助 2012-04-19 13:50:57
RNA挺好的，看PCR图，完全没有800多的带，下面有非特异性条带，你要考虑下引物的特异性，如果引物没问题那就摸摸退火温度吧

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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我就是我
4楼2012-04-19 00:01:16
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
大量弥散条带情况出现建议你做一下梯度PCR，找一下最佳退火温度，然后根据你的酶活性（酶的说明书上有）和你片段大小在设定最佳延伸时间。
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6楼2012-04-19 16:23:00
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hackett

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
摸条件吧，PCR这东西要是一次能做出来就真是运气好。
一旦做出来了重复性很好，就比较可靠了。
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Dreamer
8楼2012-04-19 22:22:34
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普通回帖

weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by wtyyyyy1988 at 2012-04-19 00:01:16:
RNA挺好的，看PCR图，完全没有800多的带，下面有非特异性条带，你要考虑下引物的特异性，如果引物没问题那就摸摸退火温度吧

谢谢
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5楼2012-04-19 11:02:04
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 超然渡陈 at 2012-04-19 16:23:00:
大量弥散条带情况出现建议你做一下梯度PCR，找一下最佳退火温度，然后根据你的酶活性（酶的说明书上有）和你片段大小在设定最佳延伸时间。

谢谢 准备摸索一下退火温度。。。酶活性延伸温度为72°，说明书上说的
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7楼2012-04-19 19:14:56
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by hackett at 2012-04-19 22:22:34:
摸条件吧，PCR这东西要是一次能做出来就真是运气好。
一旦做出来了重复性很好，就比较可靠了。

是啊  呵呵  谢谢回复
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9楼2012-04-20 08:58:29
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斯多格格

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们实验室都是预变性5min，变性30s，退火30s，延伸时间与自己的产物长度有关，一直都挺好的，你可以试试。还有就是建议你设一个内参基因看一下反转录是否正常，最好pcr时加蒸馏水对照。
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书自香我何须花
10楼2012-04-21 09:54:22
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