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[交流]
【求助/交流】RT-PCR ，内参在哪个步骤添加以及marker何时使用及确定？谢谢
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大家好， 准备做RT-PCR，看了一些资料，但是有些问题还不明； 1. 内参一定要用，但是要何时添加，在哪个步骤添加。 看到论坛上有说单独p，也有说和目的基因一起p，不是很清楚。 得到c DNA后PCR，这个体系要加入上游引物和下游引物，是不是内参就作为对照，直接P？ 内参本身是为了消除差异性，如果单独p，是如何消除的呢？如果一起P，结果出现的条带又是怎样的呢？ 2. marker 何时用，如何选择？ 提取出RNA后，要电泳鉴定其质量，此时要用marker嘛？ 最终的pcr产物，电泳也要用到marker是嘛？那内参怎么用的？ marker是否单独一个孔跑还是要和目的产物混合来跑？ marker是根据引物的产物长度来确定的还是目的基因的大小确定？ 3. 别人文献上有已知引物序列，想要使用它的序列，但是反应条件没有给出，自己要怎么确定条件呢？ 就是在找公司做引物的时候，需要注意些什么呢？他合成出的引物会有什么信息不？ 初学，也没有师兄师姐带，要直接学习，问的问题可能很幼稚，但希望高手能够指点。 下面来说下我看到的PCR的过程： 先提取出RNA （注意不要降解），然后分装，一部分用于电泳等检测RNA质量，其他4摄氏度保存，保存时间较短。 RT：按试剂盒操作。 得到的c DNA 4℃保存，保存较久。 PCR：设置反应参数等。 这个过程有用到上游引物和下游引物，是不是内参如参照一样，单独p？ 最后就是pcr产物的电泳测定，用到上样缓冲体系，怎样确定用？*的上样缓冲体系呢？ 希望大家给小的一些指点 大恩大德 感激不尽 |
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dhd997(金币+5): 辛苦。 2011-02-16 10:42:05
dhd997(金币+5): 辛苦。 2011-02-16 10:42:05
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下面来说下我看到的PCR的过程： 先提取出RNA （注意不要降解），然后分装，一部分用于电泳等检测RNA质量，其他4摄氏度保存，保存时间较短。 RT：按试剂盒操作。 得到的c DNA 4℃保存，保存较久。 PCR：设置反应参数等。 这个过程有用到上游引物和下游引物，是不是内参如参照一样，单独p？ 最后就是pcr产物的电泳测定，用到上样缓冲体系，怎样确定用？*的上样缓冲体系呢？ 答：有和前面重复的问题就不回答了； 提取出来的TotalRNA样本要保存在-80里面，或者保存在液氮里面，否则很难保存。 cDNA原则上要保存在-20里面，如果短时间内使用完则可保存在4度里。 电泳缓冲液你自己的书上找吧，任何一本基础的专业书里都有，TAE我用的比较多，也有用TBE的。各有各的优缺点。 最后给你推荐一本书，分子克隆实验指南，每天放在床头看吧，上面会回答你的一切问题，起码现阶段的一切问题都能解决了。 这问题回答的，累死我了。 |
9楼2011-02-15 11:18:49
10楼2011-02-15 11:19:48
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+5): 欢迎讨论。 2011-02-16 10:41:37
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dhd997(金币+5): 欢迎讨论。 2011-02-16 10:41:37
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你理解错了 他不是要做real-time定量PCR 而是要做普通的RT-PCR，RT-PCR是要用到内参的。 内参和目的基因分为两管PCR。 PCR的程序反应循环数要小一点，因为内参是比较模板数的差异（也就是说你P目的基因时，对照组和实验组如果加入的模板数不一致时，所以要用内参来消除加入模板量的差异），而PCR的循环数如果达到一定量的话产物的总量就会进入一个平台期，也就是说，如果你加入的模板数量不一致时，而循环数过大的话，P出来的内参的产物是一样多的，凝胶电泳时的条带几乎是差不多亮的，那这样的话就无法消除模板的差异了。而且P目的基因时，也要尽可能的少循环少加模板，否则进入平台期则无法看出差异。 |
11楼2011-02-15 16:17:25
2楼2011-02-12 01:50:56
3楼2011-02-14 13:01:01
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3): 感谢回复，鼓励交流 2011-02-15 10:25:21
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lstt09nk(金币+3): 感谢回复，鼓励交流 2011-02-15 10:25:21
| 量化因子，你就用你的一个cdna样品就可以的，但是必须要包含你所有的基因(内参和目的基因)，相当于对照，每个pcr盘里面都需要，从而计算出盘与盘之间的误差并消除他。你看看这篇文章吧，说的很清楚的：qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome biology,2007! |
4楼2011-02-15 00:07:25
5楼2011-02-15 09:40:49
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amaya1545(金币+3): 2011-02-15 22:13:55
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amaya1545(金币+3): 2011-02-15 22:13:55
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1. 内参一定要用，但是要何时添加，在哪个步骤添加。 看到论坛上有说单独p，也有说和目的基因一起p，不是很清楚。 得到c DNA后PCR，这个体系要加入上游引物和下游引物，是不是内参就作为对照，直接P？ 内参本身是为了消除差异性，如果单独p，是如何消除的呢？如果一起P，结果出现的条带又是怎样的呢？ 答：我不知道我理解的对不对，你既然用到了内参就是要做定量PCR了，每个孔做一个样本，每个样本原则上要做三个重复，内参也当做一个样本来做，同样三个重复。孔间的差异是没办法避免的，除非做多重PCR，这对引物设计的要求就比较高了。如果每个孔做一对引物原则上是只有一条条带的，如果有多个条带肯定就是有问题了，要么是引物二聚体要么是非特异扩增。 |
6楼2011-02-15 11:05:46
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+5): good 2011-02-16 10:41:13
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+5): good 2011-02-16 10:41:13
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2. marker 何时用，如何选择？ 提取出RNA后，要电泳鉴定其质量，此时要用marker嘛？ 最终的pcr产物，电泳也要用到marker是嘛？那内参怎么用的？ marker是否单独一个孔跑还是要和目的产物混合来跑？ 答：原则上讲RNA检测质量需要用变性胶来跑才行，但大家都懒，就普通的琼脂糖胶跑一下看看就好了，至于怎么用普通胶跑RNA检测窍门说过很多次了，不说了。后面你又说PCR产物跑电泳的问题，既然用了内参是做定量PCR为啥还跑电泳检测啊，那这里我当你是跑普通PCR来回答问题吧，每一个PCR管跑完了之后当一个样本，点在一个孔丽，通常讲一张胶如果不是特别的多样本的话就点一个Marker就好，用Marker已知大小的条带来粗略判断你的目标片段对不对。Marker的大小需要根据你目标序列的大小来购买不同的产品的，因为各个厂家卖的Marker大小不一样，每种Marker还有很多个条带 |
7楼2011-02-15 11:11:49
8楼2011-02-15 11:14:41
12楼2011-02-15 22:10:27
13楼2011-02-15 22:17:11
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