应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RT-PCR ，内参在哪个步骤添加以及marker何时使用及确定？谢谢
51/1返回列表
查看: 6318  |  回复: 14
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

amaya1545

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】RT-PCR ，内参在哪个步骤添加以及marker何时使用及确定？谢谢

大家好，
  准备做RT-PCR，看了一些资料，但是有些问题还不明；


   1. 内参一定要用，但是要何时添加，在哪个步骤添加。  
     看到论坛上有说单独p，也有说和目的基因一起p，不是很清楚。
     得到c DNA后PCR，这个体系要加入上游引物和下游引物，是不是内参就作为对照，直接P？ 内参本身是为了消除差异性，如果单独p，是如何消除的呢？如果一起P，结果出现的条带又是怎样的呢？


    2.  marker 何时用，如何选择？
      提取出RNA后，要电泳鉴定其质量，此时要用marker嘛？ 最终的pcr产物，电泳也要用到marker是嘛？那内参怎么用的？  marker是否单独一个孔跑还是要和目的产物混合来跑？

       marker是根据引物的产物长度来确定的还是目的基因的大小确定？

    3. 别人文献上有已知引物序列，想要使用它的序列，但是反应条件没有给出，自己要怎么确定条件呢？
        就是在找公司做引物的时候，需要注意些什么呢？他合成出的引物会有什么信息不？


   
     初学，也没有师兄师姐带，要直接学习，问的问题可能很幼稚，但希望高手能够指点。



  下面来说下我看到的PCR的过程：
    先提取出RNA （注意不要降解），然后分装，一部分用于电泳等检测RNA质量，其他4摄氏度保存，保存时间较短。
    RT：按试剂盒操作。 得到的c DNA 4℃保存，保存较久。
    PCR：设置反应参数等。 这个过程有用到上游引物和下游引物，是不是内参如参照一样，单独p？

    最后就是pcr产物的电泳测定，用到上样缓冲体系，怎样确定用？*的上样缓冲体系呢？


   希望大家给小的一些指点   大恩大德 感激不尽
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼2011-02-11 15:26:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

amaya1545

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 阿修罗Axuro at 2011-02-15 16:17:25:

你理解错了 他不是要做real-time定量PCR
而是要做普通的RT-PCR，RT-PCR是要用到内参的。
内参和目的基因分为两管PCR。
PCR的程序反应循环数要小一点，因为内参是比较模板数的差异（也就是说你P目的基因时，对 ...

是的  我是做的普通的RT-PCR  他也是这样回答的吧

   果然高手如云

   有什么问题 到时多请教大家了啊

  谢谢谢谢
赞一下 回复此楼
13楼2011-02-15 22:17:11
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

wangy0908

金虫 (正式写手)
★
silicare(金币+1): 谢谢参与 2011-02-12 12:21:26
amaya1545(金币+4): 2011-02-14 12:58:43
内参基因最好和目的基因一起扩，但并不是说放在一个管里面扩，而是分开。内参基因一定要有。如果分开扩的话，就要在两次不同的PCR里加量化因子，消除由不同pcr反应引起的误差！定的引物会有信息的，特别是退火温度，但是自己最好跑一次常规的pcr来确定。另外看了你下面的rna的问题，RNA提出出来后应该立刻保存在-80度，而不是4度，以及cDNA也应该是在-20度！
祝好运
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-02-12 01:50:56
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

amaya1545

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-02-12 01:50:56:
内参基因最好和目的基因一起扩，但并不是说放在一个管里面扩，而是分开。内参基因一定要有。如果分开扩的话，就要在两次不同的PCR里加 量化因子，消除由不同pcr反应引起的误差！定的引物会有信息的，特别是退火温度 ...

谢谢 wangy0908   
  
  还有就是 量化因子是什么  需要购买的嘛？
赞一下 回复此楼
3楼2011-02-14 13:01:01
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangy0908

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3): 感谢回复，鼓励交流 2011-02-15 10:25:21
量化因子，你就用你的一个cdna样品就可以的，但是必须要包含你所有的基因(内参和目的基因)，相当于对照，每个pcr盘里面都需要，从而计算出盘与盘之间的误差并消除他。你看看这篇文章吧，说的很清楚的：qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data.  Genome biology,2007!
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2011-02-15 00:07:25
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复(可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭