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[交流]
【求助/交流】RT-PCR ，内参在哪个步骤添加以及marker何时使用及确定？谢谢
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大家好， 准备做RT-PCR，看了一些资料，但是有些问题还不明； 1. 内参一定要用，但是要何时添加，在哪个步骤添加。 看到论坛上有说单独p，也有说和目的基因一起p，不是很清楚。 得到c DNA后PCR，这个体系要加入上游引物和下游引物，是不是内参就作为对照，直接P？ 内参本身是为了消除差异性，如果单独p，是如何消除的呢？如果一起P，结果出现的条带又是怎样的呢？ 2. marker 何时用，如何选择？ 提取出RNA后，要电泳鉴定其质量，此时要用marker嘛？ 最终的pcr产物，电泳也要用到marker是嘛？那内参怎么用的？ marker是否单独一个孔跑还是要和目的产物混合来跑？ marker是根据引物的产物长度来确定的还是目的基因的大小确定？ 3. 别人文献上有已知引物序列，想要使用它的序列，但是反应条件没有给出，自己要怎么确定条件呢？ 就是在找公司做引物的时候，需要注意些什么呢？他合成出的引物会有什么信息不？ 初学，也没有师兄师姐带，要直接学习，问的问题可能很幼稚，但希望高手能够指点。 下面来说下我看到的PCR的过程： 先提取出RNA （注意不要降解），然后分装，一部分用于电泳等检测RNA质量，其他4摄氏度保存，保存时间较短。 RT：按试剂盒操作。 得到的c DNA 4℃保存，保存较久。 PCR：设置反应参数等。 这个过程有用到上游引物和下游引物，是不是内参如参照一样，单独p？ 最后就是pcr产物的电泳测定，用到上样缓冲体系，怎样确定用？*的上样缓冲体系呢？ 希望大家给小的一些指点 大恩大德 感激不尽 |
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小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3): 感谢回复，鼓励交流 2011-02-15 10:25:21
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3): 感谢回复，鼓励交流 2011-02-15 10:25:21
| 量化因子，你就用你的一个cdna样品就可以的，但是必须要包含你所有的基因(内参和目的基因)，相当于对照，每个pcr盘里面都需要，从而计算出盘与盘之间的误差并消除他。你看看这篇文章吧，说的很清楚的：qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome biology,2007! |
4楼2011-02-15 00:07:25
