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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】荧光定量PCR与半定量的RT－PCR在设计引物时有什么区别？
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biofeixue

木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】荧光定量PCR与半定量的RT－PCR在设计引物时有什么区别？

荧光定量PCR与半定量的RT－PCR在设计引物时有什么区别？它们的产物在要求上有什么不同。谢谢！此外在NCBI中查的的序列ORIGIN后面跟是full cDNA sequence还是其它的序列？
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1楼 2011-04-01 08:26:15
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jiangzhiang

铁杆木虫 (正式写手)
★
1949stone(金币+1): 鼓励 2011-04-01 11:23:43
biofeixue(金币+2): 谢谢! 2011-04-01 12:18:59
荧光定量设计引物不能有引物二聚体，产物大小在180-220bp，半定量没什么要求吧，不过最好还是跟荧光定量用一样的引物吧
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2楼2011-04-01 09:19:15
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★
1949stone(金币+3, EPI+1): 学习一下 2011-04-01 11:24:30
biofeixue(金币+2): 2011-04-01 12:18:08
荧光定量PCR的产物不宜过长，否则会由于反应体系的过快消耗而得不到有效扩增，使反应偏离2的N次方的理论方程，这样通过方程推演进行的定量自然就不准确了。产物的大小，综合各家说法，从100 bp到150 bp比较合适，不过这范围也可以放宽到80 bp到300 bp。
荧光定量PCR如果是Sybr Green一类的方法，因为荧光染料会非特异地与双链DNA结合，包括错配产物、引物二聚体等，都会产生荧光信号干扰结果，所以引物的特异性要好，并且不要形成二聚体。
半定量看的是终产物，对于扩增长度的要求貌似没啥要求把？不确定。因为半定量的结果是从胶上看的，产物与引物二聚体的条带是可以区分开的，所以二聚体的影响就没那么严重。
其他的都差不多啦，总之就是荧光定量PCR对引物的要求比半定量要高点。
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3楼2011-04-01 11:23:08
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
biofeixue(金币+1): 谢谢! 2011-04-01 12:19:25
晕，楼主问题才回答一般就出EPI了
ORIGIN后面的序列是全部序列，具体看你查的序列是啥玩意了。
如果是基因组测序的cosmid的序列，如”Caenorhabditis elegans Cosmid F52D10, complete sequence“，那就不仅含有多个基因的序列，还包括cosmid本身的序列。
如果是“Caenorhabditis elegans chromosome III, complete sequence”，那就是整个染色体的序列了……
像“Caenorhabditis elegans insulin receptor homolog (daf-2) mRNA, complete cds”，指的是mRNA的序列。
另外，在序列开头的信息里还会有类似信息

FEATURES             Location/Qualifiers
     source          1..5817
                     /organism="Caenorhabditis elegans"
                     /mol_type="mRNA"
                     /strain="Bristol N2"
                     /db_xref="taxon:6239"
如 “/mol_type=”这一栏会告诉你整个序列是哪一类分子的。

好像还是没有回答楼主的问题呢。不如你给个链接，我们再帮你看看。
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4楼2011-04-01 11:55:40
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欢仔

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
169126楼: Originally posted by 西瓜 at 2011-04-01 11:55:40
晕，楼主问题才回答一般就出EPI了
ORIGIN后面的序列是全部序列，具体看你查的序列是啥玩意了。
如果是基因组测序的cosmid的序列，如”Caenorhabditis elegans Cosmid F52D10, complete sequence“，那就不仅 ...

你好 我想问下设计实时荧光定量的引物 有人说要跨内含子 不懂呢

我设计引物的时候用的是mRNA, complete cds  结尾的  对不
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5楼2012-07-05 11:45:07
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1269643楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-07-05 11:45:07
你好 我想问下设计实时荧光定量的引物 有人说要跨内含子 不懂呢

我设计引物的时候用的是mRNA, complete cds  结尾的  对不...

跨内含子就是说你引物分别在两个外显子上，中间有一个大的内含子。qPCR扩增的片段一般就是150~300bp，隔了个大的内含子的话，从基因组上扩增就难了，可以避免基因组DNA的污染。
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6楼2012-07-05 12:02:08
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欢仔

银虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1269644楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-07-05 12:02:08
跨内含子就是说你引物分别在两个外显子上，中间有一个大的内含子。qPCR扩增的片段一般就是150~300bp，隔了个大的内含子的话，从基因组上扩增就难了，可以避免基因组DNA的污染。...

弱弱的问下 我们设计的引物不是根据mRNA序列设计的吗  mRNA, complete cds  我看后面跟的这个 所以以为是根据MRNA序列来设计的  mRNA 不是全部都是外显子吗
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7楼2012-07-05 12:30:53
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孙妙妙

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
1269645楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-07-05 12:30:53
弱弱的问下 我们设计的引物不是根据mRNA序列设计的吗  mRNA, complete cds  我看后面跟的这个 所以以为是根据MRNA序列来设计的  mRNA 不是全部都是外显子吗 ...

同问，刚接触荧光定量，真的搞不懂啊，各位大侠帮帮忙啊。
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8楼2012-12-06 18:00:37
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夏xiao宝

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 欢仔 at 2012-07-05 12:30:53
弱弱的问下 我们设计的引物不是根据mRNA序列设计的吗  mRNA, complete cds  我看后面跟的这个 所以以为是根据MRNA序列来设计的  mRNA 不是全部都是外显子吗 ...

也同问
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9楼2013-10-20 16:38:49
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