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【求助/交流】荧光定量PCR与半定量的RT－PCR在设计引物时有什么区别？
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| 荧光定量PCR与半定量的RT－PCR在设计引物时有什么区别？它们的产物在要求上有什么不同。谢谢！此外在NCBI中查的的序列ORIGIN后面跟是full cDNA sequence还是其它的序列？ |
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 核酸生物学实验经验 |
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2楼2011-04-01 09:19:15
★ ★ ★
1949stone(金币+3, EPI+1): 学习一下 2011-04-01 11:24:30
biofeixue(金币+2): 2011-04-01 12:18:08
1949stone(金币+3, EPI+1): 学习一下 2011-04-01 11:24:30
biofeixue(金币+2): 2011-04-01 12:18:08
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荧光定量PCR的产物不宜过长，否则会由于反应体系的过快消耗而得不到有效扩增，使反应偏离2的N次方的理论方程，这样通过方程推演进行的定量自然就不准确了。产物的大小，综合各家说法，从100 bp到150 bp比较合适，不过这范围也可以放宽到80 bp到300 bp。 荧光定量PCR如果是Sybr Green一类的方法，因为荧光染料会非特异地与双链DNA结合，包括错配产物、引物二聚体等，都会产生荧光信号干扰结果，所以引物的特异性要好，并且不要形成二聚体。 半定量看的是终产物，对于扩增长度的要求貌似没啥要求把？不确定。因为半定量的结果是从胶上看的，产物与引物二聚体的条带是可以区分开的，所以二聚体的影响就没那么严重。 其他的都差不多啦，总之就是荧光定量PCR对引物的要求比半定量要高点。 |
3楼2011-04-01 11:23:08
biofeixue(金币+1): 谢谢! 2011-04-01 12:19:25
晕，楼主问题才回答一般就出EPI了 ORIGIN后面的序列是全部序列，具体看你查的序列是啥玩意了。 如果是基因组测序的cosmid的序列，如”Caenorhabditis elegans Cosmid F52D10, complete sequence“，那就不仅含有多个基因的序列，还包括cosmid本身的序列。 如果是“Caenorhabditis elegans chromosome III, complete sequence”，那就是整个染色体的序列了…… 像“Caenorhabditis elegans insulin receptor homolog (daf-2) mRNA, complete cds”，指的是mRNA的序列。 另外，在序列开头的信息里还会有类似信息 FEATURES Location/Qualifiers source 1..5817 /organism="Caenorhabditis elegans" /mol_type="mRNA" /strain="Bristol N2" /db_xref="taxon:6239" 如 “/mol_type=”这一栏会告诉你整个序列是哪一类分子的。 好像还是没有回答楼主的问题呢。不如你给个链接，我们再帮你看看。 |
4楼2011-04-01 11:55:40
5楼2012-07-05 11:45:07
6楼2012-07-05 12:02:08
7楼2012-07-05 12:30:53
8楼2012-12-06 18:00:37
9楼2013-10-20 16:38:49