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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】RT-PCR ，内参在哪个步骤添加以及marker何时使用及确定？谢谢
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amaya1545

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】RT-PCR ，内参在哪个步骤添加以及marker何时使用及确定？谢谢

大家好，
  准备做RT-PCR，看了一些资料，但是有些问题还不明；


   1. 内参一定要用，但是要何时添加，在哪个步骤添加。  
     看到论坛上有说单独p，也有说和目的基因一起p，不是很清楚。
     得到c DNA后PCR，这个体系要加入上游引物和下游引物，是不是内参就作为对照，直接P？ 内参本身是为了消除差异性，如果单独p，是如何消除的呢？如果一起P，结果出现的条带又是怎样的呢？


    2.  marker 何时用，如何选择？
      提取出RNA后，要电泳鉴定其质量，此时要用marker嘛？ 最终的pcr产物，电泳也要用到marker是嘛？那内参怎么用的？  marker是否单独一个孔跑还是要和目的产物混合来跑？

       marker是根据引物的产物长度来确定的还是目的基因的大小确定？

    3. 别人文献上有已知引物序列，想要使用它的序列，但是反应条件没有给出，自己要怎么确定条件呢？
        就是在找公司做引物的时候，需要注意些什么呢？他合成出的引物会有什么信息不？


   
     初学，也没有师兄师姐带，要直接学习，问的问题可能很幼稚，但希望高手能够指点。



  下面来说下我看到的PCR的过程：
    先提取出RNA （注意不要降解），然后分装，一部分用于电泳等检测RNA质量，其他4摄氏度保存，保存时间较短。
    RT：按试剂盒操作。 得到的c DNA 4℃保存，保存较久。
    PCR：设置反应参数等。 这个过程有用到上游引物和下游引物，是不是内参如参照一样，单独p？

    最后就是pcr产物的电泳测定，用到上样缓冲体系，怎样确定用？*的上样缓冲体系呢？


   希望大家给小的一些指点   大恩大德 感激不尽
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1楼2011-02-11 15:26:43
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amaya1545(金币+3): 2011-02-15 22:13:55
1. 内参一定要用，但是要何时添加，在哪个步骤添加。  
     看到论坛上有说单独p，也有说和目的基因一起p，不是很清楚。
     得到c DNA后PCR，这个体系要加入上游引物和下游引物，是不是内参就作为对照，直接P？ 内参本身是为了消除差异性，如果单独p，是如何消除的呢？如果一起P，结果出现的条带又是怎样的呢？

答：我不知道我理解的对不对，你既然用到了内参就是要做定量PCR了，每个孔做一个样本，每个样本原则上要做三个重复，内参也当做一个样本来做，同样三个重复。孔间的差异是没办法避免的，除非做多重PCR，这对引物设计的要求就比较高了。如果每个孔做一对引物原则上是只有一条条带的，如果有多个条带肯定就是有问题了，要么是引物二聚体要么是非特异扩增。
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6楼2011-02-15 11:05:46
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★
silicare(金币+1): 谢谢参与 2011-02-12 12:21:26
amaya1545(金币+4): 2011-02-14 12:58:43
内参基因最好和目的基因一起扩，但并不是说放在一个管里面扩，而是分开。内参基因一定要有。如果分开扩的话，就要在两次不同的PCR里加量化因子，消除由不同pcr反应引起的误差！定的引物会有信息的，特别是退火温度，但是自己最好跑一次常规的pcr来确定。另外看了你下面的rna的问题，RNA提出出来后应该立刻保存在-80度，而不是4度，以及cDNA也应该是在-20度！
祝好运
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2楼2011-02-12 01:50:56
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amaya1545

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by wangy0908 at 2011-02-12 01:50:56:
内参基因最好和目的基因一起扩，但并不是说放在一个管里面扩，而是分开。内参基因一定要有。如果分开扩的话，就要在两次不同的PCR里加 量化因子，消除由不同pcr反应引起的误差！定的引物会有信息的，特别是退火温度 ...

谢谢 wangy0908   
  
  还有就是 量化因子是什么  需要购买的嘛？
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3楼2011-02-14 13:01:01
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wangy0908

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3): 感谢回复，鼓励交流 2011-02-15 10:25:21
量化因子，你就用你的一个cdna样品就可以的，但是必须要包含你所有的基因(内参和目的基因)，相当于对照，每个pcr盘里面都需要，从而计算出盘与盘之间的误差并消除他。你看看这篇文章吧，说的很清楚的：qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data.  Genome biology,2007!
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4楼2011-02-15 00:07:25
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