| 查看: 7229 | 回复: 14 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
【求助/交流】RT-PCR ，内参在哪个步骤添加以及marker何时使用及确定？谢谢
|
|||
|
大家好， 准备做RT-PCR，看了一些资料，但是有些问题还不明； 1. 内参一定要用，但是要何时添加，在哪个步骤添加。 看到论坛上有说单独p，也有说和目的基因一起p，不是很清楚。 得到c DNA后PCR，这个体系要加入上游引物和下游引物，是不是内参就作为对照，直接P？ 内参本身是为了消除差异性，如果单独p，是如何消除的呢？如果一起P，结果出现的条带又是怎样的呢？ 2. marker 何时用，如何选择？ 提取出RNA后，要电泳鉴定其质量，此时要用marker嘛？ 最终的pcr产物，电泳也要用到marker是嘛？那内参怎么用的？ marker是否单独一个孔跑还是要和目的产物混合来跑？ marker是根据引物的产物长度来确定的还是目的基因的大小确定？ 3. 别人文献上有已知引物序列，想要使用它的序列，但是反应条件没有给出，自己要怎么确定条件呢？ 就是在找公司做引物的时候，需要注意些什么呢？他合成出的引物会有什么信息不？ 初学，也没有师兄师姐带，要直接学习，问的问题可能很幼稚，但希望高手能够指点。 下面来说下我看到的PCR的过程： 先提取出RNA （注意不要降解），然后分装，一部分用于电泳等检测RNA质量，其他4摄氏度保存，保存时间较短。 RT：按试剂盒操作。 得到的c DNA 4℃保存，保存较久。 PCR：设置反应参数等。 这个过程有用到上游引物和下游引物，是不是内参如参照一样，单独p？ 最后就是pcr产物的电泳测定，用到上样缓冲体系，怎样确定用？*的上样缓冲体系呢？ 希望大家给小的一些指点 大恩大德 感激不尽 |
回复此楼» 猜你喜欢
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有279人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
-
氢氧化钾活化操作
已经有18人回复
-
散金
已经有68人回复
-
生物质超级电容器
已经有0人回复
-
ALK5 高选择性小分子 LY-3200882：可放大合成路线与质控要点解析
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 循环伏安法沉积铂，沉积的铂量怎么确定
已经有3人回复
- pcr 带好宽啊!苦恼，求助ing!
已经有21人回复
- PCR时出现了非目的片段的超大片段条带
已经有16人回复
- 求助，已有PDB结构的DS同源建模步骤，谢谢
已经有11人回复
- 基因组dna检测条带很亮 PCR扩增后条带非常弱 求助
已经有3人回复
- 求助：模拟过程（或者：step_2）中，添加 Tie 约束，如何添加？
已经有5人回复
- 求助：约6kb质粒做模板的pcr程序怎么设定啊
已经有12人回复
- 发现了beta actin作为内参的一个漏洞
已经有25人回复
- 做pcr时pcr管子变形严重是怎么回事？
已经有21人回复
- 菌落PCR筛选
已经有17人回复
- 【求助/交流】荧光定量PCR与半定量的RT－PCR在设计引物时有什么区别？
已经有8人回复
- 【求助/交流】做培养细胞的RT-PCR，β-actin内参出现两个条带，求原因。
已经有10人回复
- 【求助/交流】RTPCR 内参
已经有4人回复
10楼2011-02-15 11:19:48
2楼2011-02-12 01:50:56
3楼2011-02-14 13:01:01
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3): 感谢回复，鼓励交流 2011-02-15 10:25:21
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3): 感谢回复，鼓励交流 2011-02-15 10:25:21
| 量化因子，你就用你的一个cdna样品就可以的，但是必须要包含你所有的基因(内参和目的基因)，相当于对照，每个pcr盘里面都需要，从而计算出盘与盘之间的误差并消除他。你看看这篇文章吧，说的很清楚的：qBase relative quantification framework and software for management and automated analysis of real-time quantitative PCR data. Genome biology,2007! |
4楼2011-02-15 00:07:25
30