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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » rt-pcr图，请大神们帮助分析一下，急。。。谢谢。。。
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 斯多格格 at 2012-04-21 09:54:22:
我们实验室都是预变性5min，变性30s，退火30s，延伸时间与自己的产物长度有关，一直都挺好的，你可以试试。还有就是建议你设一个内参基因看一下反转录是否正常，最好pcr时加蒸馏水对照。

谢谢您的建议
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11楼2012-04-21 13:38:58
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看了楼主的设定参数，这么小的条带，用不着这么长的时间。给个参考设定：1 94℃       2 min
2 94℃     30s
3 退火温度    30s
4 72度     1min
35个循环
5 72度     10min
6 4度

退火温度的话，可以看你的引物合成单，比单子上面的温度稍微低2℃就可以。最好还是弄个温度梯度，找个最适的退火温度。  退火温度不宜太低（49℃），太低的话可能造成非特异性扩增！！
  一般的话，退火温度在55℃就能扩增出条带！！

试试吧，分子就这样，不太好做！！个人觉得人品吧重要的很！！  祝君好运！！
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勤能补拙
12楼2012-04-25 11:26:11
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
weining1203: 金币+5, ★有帮助 2012-04-25 14:31:11
看了楼主的设定参数，这么小的条带，用不着这么长的时间。给个参考设定：1 94℃       2 min
2 94℃     30s
3 退火温度    30s
4 72度     1min
35个循环
5 72度     10min
6 4度

退火温度的话，可以看你的引物合成单，比单子上面的温度稍微低2℃就可以。最好还是弄个温度梯度，找个最适的退火温度。  退火温度不宜太低（49℃），太低的话可能造成非特异性扩增！！
  一般的话，退火温度在55℃就能扩增出条带！！

试试吧，分子就这样，不太好做！！个人觉得人品吧重要的很！！  祝君好运！！
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勤能补拙
13楼2012-04-25 11:27:34
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by wushuwei1104 at 2012-04-25 11:27:34:
看了楼主的设定参数，这么小的条带，用不着这么长的时间。给个参考设定：1 94℃       2 min
2 94℃     30s
3 退火温度    30s
4 72度     1min
35个循环
5 72度     10min
6 4度

退火温度的话，可以看 ...

谢谢，难道我人品有问题？？？老是不出结果，愁死了。。。
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14楼2012-04-25 14:31:44
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by wushuwei1104 at 2012-04-25 11:27:34:
看了楼主的设定参数，这么小的条带，用不着这么长的时间。给个参考设定：1 94℃       2 min
2 94℃     30s
3 退火温度    30s
4 72度     1min
35个循环
5 72度     10min
6 4度

退火温度的话，可以看 ...

合成单上的Tm值很低，才44度。。。 我都不敢往下降了。。。看文献上该引物退货温度一般是49度左右。。。还有一个是65度。。。
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15楼2012-04-25 14:42:31
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by weining1203 at 2012-04-25 14:42:31:
合成单上的Tm值很低，才44度。。。 我都不敢往下降了。。。看文献上该引物退货温度一般是49度左右。。。还有一个是65度。。。

呵呵，44℃是有点低！！ 那你就试试44℃。你说的一个是49度，一个是65度是什么意思？是一个基因前后引物的两个退火温度，还是两个不同基因的引物的退火温度?
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勤能补拙
16楼2012-04-25 19:45:11
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by wushuwei1104 at 2012-04-25 19:45:11:
呵呵，44℃是有点低！！ 那你就试试44℃。你说的一个是49度，一个是65度是什么意思？是一个基因前后引物的两个退火温度，还是两个不同基因的引物的退火温度?

同一个引物 两片文章上用的不同的退火温度。。。一个用49 一个用65
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17楼2012-04-25 22:34:14
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wushuwei1104

银虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by weining1203 at 2012-04-25 22:34:14:
同一个引物 两片文章上用的不同的退火温度。。。一个用49 一个用65

我赛，相同的引物不同的文章里面出现的退火温度竟然相差这么大！！！  文献是中文还是英文？  这个得好好研究研究，难道说两个温度都可以批出条带来？  建议楼主还是自己试一试，不妨做个温度梯度，探究一下引物的真正的最适退火温度！！
祝实验顺利！！
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勤能补拙
18楼2012-04-26 09:30:56
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weining1203

新虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by wushuwei1104 at 2012-04-26 09:30:56:
我赛，相同的引物不同的文章里面出现的退火温度竟然相差这么大！！！  文献是中文还是英文？  这个得好好研究研究，难道说两个温度都可以批出条带来？  建议楼主还是自己试一试，不妨做个温度梯度，探究一下引物 ...

中文的文章。。。呵呵 我也有点奇怪
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19楼2012-04-26 13:06:10
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晓风残月cl

新虫 (正式写手)
1  RNA中有明显的基因组DNA污染   你没看到吗   如果做表达就算了 要求不是特高   如果是文库什么的   还要纯化RNA的
2 cDNA电泳图一般为拖的带   从你PCR结果看  应该有目的带   但是杂带也有   建议梯度摸索退火温度
3 我觉得你的PCR步骤有点奇怪   我们一般退火都用的30s就够了    你能解释一下为什么用1分钟么
4  楼主跑胶的水平有待提高
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weining1203
20楼2012-04-26 15:18:50
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