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weining1203新虫 (小有名气)
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[求助]
rt-pcr图，请大神们帮助分析一下，急。。。谢谢。。。
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大神们请帮忙分析一下RT-PCR电泳图，第一次做不明白什么原因。。。第一张是rna图，后两张是曝光度不同的pcr图。目的条带应该为850bp左右，引物为简并引物，图上最大的条带好像只有500bp，最小100bp，marker为DL2000，请好心虫友帮助分析一下，哪里出了问题，应该怎样设置pcr程序，引物和pcr条件都是文献上的。。。急。。。pcr程序： 1 94℃ 4min 2 94℃ 1min 3 49度 1min 4 72度 1min 32个循环 5 72度 10min 6 4度  rna   问题补充：rt-pcr试剂盒为宝生物 RNA PCR KIT(AMV) Ver.3.0, 酶为takala EX Taq HS 兼并引物长度20bp [ Last edited by weining1203 on 2012-4-18 at 11:25 ] |
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wushuwei1104
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【答案】应助回帖
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weining1203: 金币+5, ★有帮助 2012-04-25 14:31:11
weining1203: 金币+5, ★有帮助 2012-04-25 14:31:11
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看了楼主的设定参数，这么小的条带，用不着这么长的时间。给个参考设定：1 94℃ 2 min 2 94℃ 30s 3 退火温度 30s 4 72度 1min 35个循环 5 72度 10min 6 4度 退火温度的话，可以看你的引物合成单，比单子上面的温度稍微低2℃就可以。最好还是弄个温度梯度，找个最适的退火温度。 退火温度不宜太低（49℃），太低的话可能造成非特异性扩增！！ 一般的话，退火温度在55℃就能扩增出条带！！ 试试吧，分子就这样，不太好做！！个人觉得人品吧重要的很！！ 祝君好运！！ |
13楼2012-04-25 11:27:34
cheng_xiao
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2楼2012-04-18 20:14:59
weining1203
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3楼2012-04-18 21:48:57
wtyyyyy1988
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4楼2012-04-19 00:01:16