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忆-雪

银虫 (小有名气)

[求助] 急求RT-PCR电泳图分析 已有1人参与

急求各位高手忙我分析分析这是什么原因，第一张和第3张图右边的条带呈涂抹状，这是为什么？
图1：退火温度55度，为什么与marker相邻的两孔目的条带上下有条带，而另外两空却没有？（前两空和后两空模板合成时间不一样，后两孔模板合成快1周了，前两空是今天合成的。）
图2：退火温度58度，为什么后面几个条带呈涂抹状，是因为退火温度太高了吗？内参条带很亮，内参条带旁边的两空的条带跟我参考的文献片段长短不一样，文献报道是266bp,而我扩增出来的是300多bp，我合成的引物跟文献完全一致，这是为什么，难道这不是我的目的基因吗？我重复试验3次，结果都一样。
图3：退火温度48度，结果同图2后面条带一致，呈涂抹状，我试过50度，55度，结果都是涂抹状，这是为什么?
扩增体系是20ul,其中引物1ul,cDNA2ul
PCR条件：94度，5min;94度 30s;退火温度上述温度；72度45s，循环30次，72度 7min.

现在很是惆怅，希望各位高手帮我这菜鸟分析分析！

内参图，退火温度55度



内参和样品图



48度样品图
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1楼 2012-03-29 00:06:09
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回帖置顶 ( 共有1个 )

忆-雪

银虫 (小有名气)
西瓜: 回帖置顶 2012-04-02 11:36:46
引用回帖:
14楼: Originally posted by ding218 at 2012-04-01 08:31:37:
还有一种可能，就是这个基因在你的样本中不表达。

表达呢，昨天我在58°p出来了，但是条带比较淡，我循环了39次，退火温度57时也P出来了，但是有其他非特异性条带，我下一步该如何做呢
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15楼2012-04-02 09:16:32
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 热心啊，分子版太喜欢你了 2012-03-29 10:22:41
忆-雪: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢，对我很有帮助 2012-03-30 10:18:07
忆-雪: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-21 01:57:15
嗯 个人看法：
1. 这种涂抹，也就是Smear，简称弥散带，在条带上还是条带下Smear都是有讲究的，一般单单是上部Smear普遍是Template过量，上下都Smear就问题多了，退火时间长、退火温度低等等太多了，建议找TaKaRa官方网站去看问题集解，会有详细说明。单单条带下Smear，我还没有见过........
2. 图二，有特异产物范围内的Smear，恰恰与你说法相反，退火温度可能过低了，需要5度5度往上调做大范围尝试，再2度微调，还有你认为条带范围不符，那很正常，我觉得在测序前一切都不好说，因为酶Buffer引起条带滞后性，因为胶没混匀引起滞后性偶都见过，还有一次，我对比Marker发现我克隆的Gene高了数百bp，最后去测序，其实是正确滴。
3. 图三，有根据你的引物来优化你的Tm吗？看你从48试到55......变化范围蛮大.....其实我感觉若你图三的扩增子长也是300左右bp的话，结合你变性温度和时间，应该用的是普通Taq，45s的延伸未免就太长了，45s的话Taq都能延1kb了，所以时间也需要优化。
希望能有所帮助 若有说错，请高手指正
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Let God do with it as He wills
2楼2012-03-29 00:36:38
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atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
西瓜: , 个人喜好，淡定 ╮(╯_╰)╭ 2012-03-29 17:34:04
突然发现一个问题
你为什么要把照片反着放~~~~~~~~~~~~~~！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！
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Let God do with it as He wills
3楼2012-03-29 00:53:51
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lwtong8320

金虫 (正式写手)
我们看胶时，一般是要把有胶孔的一面放在上面的，所以二楼说你的放反了！
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努力！努力！再努力！
9楼2012-03-30 13:00:22
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
忆-雪: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-03-31 10:11:14
模板的量我觉得有点大，我跑100ul的体系的时候一共加2ulcDNA
另外，你说的你的引物是文献的，你做了BLAST了么
有时候文献的引物会写错一两个碱基。。。自己仔细比对下
另外，做之前，要做个内参，看看你模板的质量。。。
祝好运
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10楼2012-03-30 19:34:49
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普通回帖

孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小哥，你在跑胶时电泳槽正负极放反了，记得下次跑胶时把负极放在上面，这样样品就会往下跑，而不是像你跑的这样了
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4楼2012-03-29 15:12:16
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-29 00:36:38:
嗯 个人看法：
1. 这种涂抹，也就是Smear，简称弥散带，在条带上还是条带下Smear都是有讲究的，一般单单是上部Smear普遍是Template过量，上下都Smear就问题多了，退火时间长、退火温度低等等太多了，建议找TaKaR ...

只有条带下面有smear，也可能是DNA有降解吧~个人意见
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5楼2012-03-29 17:35:21
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忆-雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-29 00:53:51:
突然发现一个问题
你为什么要把照片反着放~~~~~~~~~~~~~~！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！

反了？
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6楼2012-03-30 10:18:59
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忆-雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-03-29 15:12:16:
小哥，你在跑胶时电泳槽正负极放反了，记得下次跑胶时把负极放在上面，这样样品就会往下跑，而不是像你跑的这样了

不是从负极往正极跑吗？放上放下有区别吗？
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7楼2012-03-30 10:19:57
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忆-雪

银虫 (小有名气)
内容已删除
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8楼2012-03-30 10:30:20
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