应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 急求RT-PCR电泳图分析
231/3返回列表123下一页
查看: 5212  |  回复: 22
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

忆-雪

银虫 (小有名气)

[求助] 急求RT-PCR电泳图分析 已有1人参与

急求各位高手忙我分析分析这是什么原因，第一张和第3张图右边的条带呈涂抹状，这是为什么？
图1：退火温度55度，为什么与marker相邻的两孔目的条带上下有条带，而另外两空却没有？（前两空和后两空模板合成时间不一样，后两孔模板合成快1周了，前两空是今天合成的。）
图2：退火温度58度，为什么后面几个条带呈涂抹状，是因为退火温度太高了吗？内参条带很亮，内参条带旁边的两空的条带跟我参考的文献片段长短不一样，文献报道是266bp,而我扩增出来的是300多bp，我合成的引物跟文献完全一致，这是为什么，难道这不是我的目的基因吗？我重复试验3次，结果都一样。
图3：退火温度48度，结果同图2后面条带一致，呈涂抹状，我试过50度，55度，结果都是涂抹状，这是为什么?
扩增体系是20ul,其中引物1ul,cDNA2ul
PCR条件：94度，5min;94度 30s;退火温度上述温度；72度45s，循环30次，72度 7min.

现在很是惆怅，希望各位高手帮我这菜鸟分析分析！

内参图，退火温度55度



内参和样品图



48度样品图
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生物

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-03-29 00:06:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

忆-雪

银虫 (小有名气)
西瓜: 回帖置顶 2012-04-02 11:36:46
引用回帖:
14楼: Originally posted by ding218 at 2012-04-01 08:31:37:
还有一种可能，就是这个基因在你的样本中不表达。

表达呢，昨天我在58°p出来了，但是条带比较淡，我循环了39次，退火温度57时也P出来了，但是有其他非特异性条带，我下一步该如何做呢
赞一下 回复此楼
15楼2012-04-02 09:16:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 热心啊，分子版太喜欢你了 2012-03-29 10:22:41
忆-雪: 金币+5, ★★★很有帮助, 谢谢，对我很有帮助 2012-03-30 10:18:07
忆-雪: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-07-21 01:57:15
嗯 个人看法：
1. 这种涂抹，也就是Smear，简称弥散带，在条带上还是条带下Smear都是有讲究的，一般单单是上部Smear普遍是Template过量，上下都Smear就问题多了，退火时间长、退火温度低等等太多了，建议找TaKaRa官方网站去看问题集解，会有详细说明。单单条带下Smear，我还没有见过........
2. 图二，有特异产物范围内的Smear，恰恰与你说法相反，退火温度可能过低了，需要5度5度往上调做大范围尝试，再2度微调，还有你认为条带范围不符，那很正常，我觉得在测序前一切都不好说，因为酶Buffer引起条带滞后性，因为胶没混匀引起滞后性偶都见过，还有一次，我对比Marker发现我克隆的Gene高了数百bp，最后去测序，其实是正确滴。
3. 图三，有根据你的引物来优化你的Tm吗？看你从48试到55......变化范围蛮大.....其实我感觉若你图三的扩增子长也是300左右bp的话，结合你变性温度和时间，应该用的是普通Taq，45s的延伸未免就太长了，45s的话Taq都能延1kb了，所以时间也需要优化。
希望能有所帮助 若有说错，请高手指正
赞一下(1人) 回复此楼
Let God do with it as He wills
2楼2012-03-29 00:36:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

atlanticwi

金虫 (正式写手)

琴美喜欢发呆 不喜欢发脾气
西瓜: , 个人喜好，淡定 ╮(╯_╰)╭ 2012-03-29 17:34:04
突然发现一个问题
你为什么要把照片反着放~~~~~~~~~~~~~~！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！
赞一下(1人) 回复此楼
Let God do with it as He wills
3楼2012-03-29 00:53:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwtong8320

金虫 (正式写手)
我们看胶时，一般是要把有胶孔的一面放在上面的，所以二楼说你的放反了！
赞一下(1人) 回复此楼
努力！努力！再努力！
9楼2012-03-30 13:00:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
忆-雪: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-03-31 10:11:14
模板的量我觉得有点大，我跑100ul的体系的时候一共加2ulcDNA
另外，你说的你的引物是文献的，你做了BLAST了么
有时候文献的引物会写错一两个碱基。。。自己仔细比对下
另外，做之前，要做个内参，看看你模板的质量。。。
祝好运
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2012-03-30 19:34:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
小哥，你在跑胶时电泳槽正负极放反了，记得下次跑胶时把负极放在上面，这样样品就会往下跑，而不是像你跑的这样了
赞一下 回复此楼
4楼2012-03-29 15:12:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

西瓜

荣誉版主 (知名作家)
引用回帖:
2楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-29 00:36:38:
嗯 个人看法：
1. 这种涂抹，也就是Smear，简称弥散带，在条带上还是条带下Smear都是有讲究的，一般单单是上部Smear普遍是Template过量，上下都Smear就问题多了，退火时间长、退火温度低等等太多了，建议找TaKaR ...

只有条带下面有smear，也可能是DNA有降解吧~个人意见
赞一下 回复此楼
5楼2012-03-29 17:35:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

忆-雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by atlanticwi at 2012-03-29 00:53:51:
突然发现一个问题
你为什么要把照片反着放~~~~~~~~~~~~~~！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！！

反了？
回复此楼
6楼2012-03-30 10:18:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

忆-雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-03-29 15:12:16:
小哥，你在跑胶时电泳槽正负极放反了，记得下次跑胶时把负极放在上面，这样样品就会往下跑，而不是像你跑的这样了

不是从负极往正极跑吗？放上放下有区别吗？
赞一下 回复此楼
7楼2012-03-30 10:19:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

忆-雪

银虫 (小有名气)
内容已删除
回复此楼
8楼2012-03-30 10:30:20
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 忆-雪 的主题更新
231/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 基金啊基金 +3 longfie172 2026-08-20 3/150 2026-08-21 00:04 by wuchongjun
[基金申请] 科研孤儿太难了 +14 我4大白菜 2026-08-20 15/750 2026-08-20 22:33 by 袁向阳007
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 放榜前的不淡定 40+3 snowwithsea 2026-08-19 12/600 2026-08-20 15:56 by lfy8008
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 13/650 2026-08-19 21:28 by aasahr
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 今天放榜吗？ +14 布布和一二 2026-08-19 15/750 2026-08-19 18:07 by gltch
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +10 wangze12014 2026-08-14 12/600 2026-08-19 16:56 by 苦难博士
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 朋友圈看到的 +6 wangzilk 2026-08-18 8/400 2026-08-19 10:55 by Haru815
[基金申请] 快农历七夕节了，轻松一下，男人悄悄话，女施主请不要进来。 +6 Tide man 2026-08-14 7/350 2026-08-19 09:56 by ZJTJZ
[基金申请] 什么时候开奖？ +6 CrisMessi 2026-08-18 6/300 2026-08-19 08:06 by Equinoxhua
[基金申请] 明天放榜？ +5 Shxjjxjkx 2026-08-18 5/250 2026-08-18 18:14 by -大大大大大-
[论文投稿] 投稿咨询 +4 wwm09 2026-08-17 6/300 2026-08-18 15:36 by wwm09
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +14 archvillain 2026-08-15 26/1300 2026-08-18 13:37 by phantomgost
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭