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忆-雪银虫 (小有名气)
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[求助]
急求RT-PCR电泳图分析 已有1人参与
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急求各位高手忙我分析分析这是什么原因，第一张和第3张图右边的条带呈涂抹状，这是为什么？ 图1：退火温度55度，为什么与marker相邻的两孔目的条带上下有条带，而另外两空却没有？（前两空和后两空模板合成时间不一样，后两孔模板合成快1周了，前两空是今天合成的。） 图2：退火温度58度，为什么后面几个条带呈涂抹状，是因为退火温度太高了吗？内参条带很亮，内参条带旁边的两空的条带跟我参考的文献片段长短不一样，文献报道是266bp,而我扩增出来的是300多bp，我合成的引物跟文献完全一致，这是为什么，难道这不是我的目的基因吗？我重复试验3次，结果都一样。 图3：退火温度48度，结果同图2后面条带一致，呈涂抹状，我试过50度，55度，结果都是涂抹状，这是为什么? 扩增体系是20ul,其中引物1ul,cDNA2ul PCR条件：94度，5min;94度 30s;退火温度上述温度；72度45s，循环30次，72度 7min. 现在很是惆怅，希望各位高手帮我这菜鸟分析分析！  内参图，退火温度55度  内参和样品图  48度样品图 |
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【答案】应助回帖
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嗯 个人看法： 1. 这种涂抹，也就是Smear，简称弥散带，在条带上还是条带下Smear都是有讲究的，一般单单是上部Smear普遍是Template过量，上下都Smear就问题多了，退火时间长、退火温度低等等太多了，建议找TaKaRa官方网站去看问题集解，会有详细说明。单单条带下Smear，我还没有见过........ 2. 图二，有特异产物范围内的Smear，恰恰与你说法相反，退火温度可能过低了，需要5度5度往上调做大范围尝试，再2度微调，还有你认为条带范围不符，那很正常，我觉得在测序前一切都不好说，因为酶Buffer引起条带滞后性，因为胶没混匀引起滞后性偶都见过，还有一次，我对比Marker发现我克隆的Gene高了数百bp，最后去测序，其实是正确滴。 3. 图三，有根据你的引物来优化你的Tm吗？看你从48试到55......变化范围蛮大.....其实我感觉若你图三的扩增子长也是300左右bp的话，结合你变性温度和时间，应该用的是普通Taq，45s的延伸未免就太长了，45s的话Taq都能延1kb了，所以时间也需要优化。 希望能有所帮助  若有说错，请高手指正 |
2楼2012-03-29 00:36:38
atlanticwi
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