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忆-雪

银虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-03-30 19:34:49:
模板的量我觉得有点大,我跑100ul的体系的时候一共加2ulcDNA
另外,你说的你的引物是文献的,你做了BLAST了么
有时候文献的引物会写错一两个碱基。。。自己仔细比对下
另外,做之前,要做个内参,看看你模板的 ...

后面实验的时候放内参了,每次内参都出来,查看文献的引物没有做BLAST,我是个初学者,也不是这个专业的,不是很清楚该怎样做,一直是自己摸索着做的,多谢你的提醒哈。我的内参cDNA加0.5ul就出来很亮的条带了,但样品加1ul才出来,其中一个基因20ul体系加了2ulcDNA才出的条带,还有一个基因,我试过模板加入量分别为0.5ul,1ul,2ul,退火温度分别为45,48,50,55,58度,内参条带清晰,但样品条带一直是smear,重复实验结果不变,能帮我分析分析原因吗?谢谢啦
11楼2012-03-31 10:18:29
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忆-雪

银虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by lwtong8320 at 2012-03-30 13:00:22:
我们看胶时,一般是要把有胶孔的一面放在上面的,所以二楼说你的放反了!

奥,谢谢,我没有注意到这点,呵呵
12楼2012-03-31 10:19:18
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xujiemeng09

金虫 (正式写手)

引用回帖:
11楼: Originally posted by 忆-雪 at 2012-03-31 10:18:29:
后面实验的时候放内参了,每次内参都出来,查看文献的引物没有做BLAST,我是个初学者,也不是这个专业的,不是很清楚该怎样做,一直是自己摸索着做的,多谢你的提醒哈。我的内参cDNA加0.5ul就出来很亮的条带了, ...

换引物试试
你若不想做,会找到一个借口;你若想做,会找到一个方法。
13楼2012-04-01 02:57:18
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ding218

木虫 (正式写手)

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还有一种可能,就是这个基因在你的样本中不表达。
14楼2012-04-01 08:31:37
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忆-雪

银虫 (小有名气)

西瓜: 回帖置顶 2012-04-02 11:36:46
引用回帖:
14楼: Originally posted by ding218 at 2012-04-01 08:31:37:
还有一种可能,就是这个基因在你的样本中不表达。

表达呢,昨天我在58°p出来了,但是条带比较淡,我循环了39次,退火温度57时也P出来了,但是有其他非特异性条带,我下一步该如何做呢
15楼2012-04-02 09:16:32
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

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引用回帖:
15楼: Originally posted by 忆-雪 at 2012-04-02 09:16:32:
表达呢,昨天我在58°p出来了,但是条带比较淡,我循环了39次,退火温度57时也P出来了,但是有其他非特异性条带,我下一步该如何做呢

39次循环太多了,只要稍微有点非特异结合,在这么多轮循环之后也能扩增出产物的。建议还是用30个循环。
16楼2012-04-02 11:39:22
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忆-雪

银虫 (小有名气)

引用回帖:
16楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-04-02 11:39:22:
39次循环太多了,只要稍微有点非特异结合,在这么多轮循环之后也能扩增出产物的。建议还是用30个循环。

30个循环做了,P不出来,35个也P不出来,又改回39个P出来了,这该怎么办
17楼2012-04-03 20:15:07
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jocelyn2012

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

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8楼: Originally posted by 忆-雪 at 2012-03-30 10:30:20:
我的DNA电泳检测5s,18s,28s全都有,应该没有降解吧

话说5s,18s,28s这是说RNA的吧
18楼2012-04-29 14:23:03
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jocelyn2012

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜: 金币+3, 鼓励交流~ 2012-04-29 17:31:39
出现smear情绪应该很纠结,一,你要的东西存在;二、条件不对,还有漫长的路在前方等待。
提供点意见供参考:1,找台梯度PCR仪从45度到65度范围内(可适当调整)做个退火温度的PCR,找出最佳退火温度。循环数尽量不要太大(20-30),若担心量少看不见,可以跑胶时多上点样。2,300bp的话延伸时间20s就够了,不要浪费时间,还容易扩出杂带(此点与smear关系不大)
19楼2012-04-29 14:32:43
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by 忆-雪 at 2012-04-03 20:15:07:
30个循环做了,P不出来,35个也P不出来,又改回39个P出来了,这该怎么办

不好意思,刚看到……39个循环才P出来,我觉得是非特异扩增了。你的阴性对照怎么样(用水代替模板)?
20楼2012-04-29 17:33:03
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