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忆-雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by mamadexiao at 2012-03-30 19:34:49:
模板的量我觉得有点大，我跑100ul的体系的时候一共加2ulcDNA
另外，你说的你的引物是文献的，你做了BLAST了么
有时候文献的引物会写错一两个碱基。。。自己仔细比对下
另外，做之前，要做个内参，看看你模板的 ...

后面实验的时候放内参了，每次内参都出来，查看文献的引物没有做BLAST，我是个初学者，也不是这个专业的，不是很清楚该怎样做，一直是自己摸索着做的，多谢你的提醒哈。我的内参cDNA加0.5ul就出来很亮的条带了，但样品加1ul才出来，其中一个基因20ul体系加了2ulcDNA才出的条带，还有一个基因，我试过模板加入量分别为0.5ul,1ul,2ul,退火温度分别为45,48,50,55,58度，内参条带清晰，但样品条带一直是smear，重复实验结果不变，能帮我分析分析原因吗？谢谢啦
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11楼2012-03-31 10:18:29
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忆-雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by lwtong8320 at 2012-03-30 13:00:22:
我们看胶时，一般是要把有胶孔的一面放在上面的，所以二楼说你的放反了！

奥，谢谢，我没有注意到这点，呵呵
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12楼2012-03-31 10:19:18
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xujiemeng09

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by 忆-雪 at 2012-03-31 10:18:29:
后面实验的时候放内参了，每次内参都出来，查看文献的引物没有做BLAST，我是个初学者，也不是这个专业的，不是很清楚该怎样做，一直是自己摸索着做的，多谢你的提醒哈。我的内参cDNA加0.5ul就出来很亮的条带了， ...

换引物试试
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你若不想做，会找到一个借口；你若想做，会找到一个方法。
13楼2012-04-01 02:57:18
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ding218

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
还有一种可能，就是这个基因在你的样本中不表达。
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14楼2012-04-01 08:31:37
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忆-雪

银虫 (小有名气)
西瓜: 回帖置顶 2012-04-02 11:36:46
引用回帖:
14楼: Originally posted by ding218 at 2012-04-01 08:31:37:
还有一种可能，就是这个基因在你的样本中不表达。

表达呢，昨天我在58°p出来了，但是条带比较淡，我循环了39次，退火温度57时也P出来了，但是有其他非特异性条带，我下一步该如何做呢
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15楼2012-04-02 09:16:32
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
15楼: Originally posted by 忆-雪 at 2012-04-02 09:16:32:
表达呢，昨天我在58°p出来了，但是条带比较淡，我循环了39次，退火温度57时也P出来了，但是有其他非特异性条带，我下一步该如何做呢

39次循环太多了，只要稍微有点非特异结合，在这么多轮循环之后也能扩增出产物的。建议还是用30个循环。
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16楼2012-04-02 11:39:22
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忆-雪

银虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 西瓜 at 2012-04-02 11:39:22:
39次循环太多了，只要稍微有点非特异结合，在这么多轮循环之后也能扩增出产物的。建议还是用30个循环。

30个循环做了，P不出来，35个也P不出来，又改回39个P出来了，这该怎么办
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17楼2012-04-03 20:15:07
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jocelyn2012

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
8楼: Originally posted by 忆-雪 at 2012-03-30 10:30:20:
我的DNA电泳检测5s,18s,28s全都有，应该没有降解吧

话说5s，18s，28s这是说RNA的吧
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18楼2012-04-29 14:23:03
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jocelyn2012

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
西瓜: 金币+3, 鼓励交流~ 2012-04-29 17:31:39
出现smear情绪应该很纠结，一，你要的东西存在；二、条件不对，还有漫长的路在前方等待。
提供点意见供参考：1，找台梯度PCR仪从45度到65度范围内（可适当调整）做个退火温度的PCR，找出最佳退火温度。循环数尽量不要太大(20-30),若担心量少看不见，可以跑胶时多上点样。2，300bp的话延伸时间20s就够了，不要浪费时间，还容易扩出杂带（此点与smear关系不大）
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19楼2012-04-29 14:32:43
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
17楼: Originally posted by 忆-雪 at 2012-04-03 20:15:07:
30个循环做了，P不出来，35个也P不出来，又改回39个P出来了，这该怎么办

不好意思，刚看到……39个循环才P出来，我觉得是非特异扩增了。你的阴性对照怎么样（用水代替模板）？
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20楼2012-04-29 17:33:03
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