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树宝宝zyx

新虫 (小有名气)

[求助] 我的PCR电泳图怎么这样的啊。。。

我用的是底泥提取出来的DNA，其260/280,260/230达到1.8,1.9的样子，应该还不错。我选用的引物是16SrDNA V3区的通用引物，27F和1495R。PCR条件是参考文献的，采用降落式。为什么电泳图会变成这样呢。自右手边起第一个是Marker，第二个是空白，而且我每次做的空白经常会有条带出现，做了好多次总是不能出现满意的结果，很着急。请各位不吝赐教，先谢谢了。

PCR电泳图
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科研真辛苦！
1楼2011-10-13 10:26:23
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asznpb

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
amisking(金币+2): 鼓励发帖交流！ 2011-10-13 19:46:12
1,方向反了，一般习惯都是胶孔在上面
2，从你的marker来看，应该是电泳除了问题
建议更换新的电泳液，重新做胶（琼脂糖浓度高一些，胶硬一些），还有就是降低电压重新跑
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树宝宝zyx
显微镜下的世界很精彩！
2楼2011-10-13 11:04:12
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asznpb

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

树宝宝zyx(金币+2): 2011-10-13 16:20:59
空白出条带，请问是怎么设置的空白？只有水？还是除了底物之外都加了？如果是后者的话可能是引物二聚体，或者是别的东西有DNA污染了，如果是前者，那就神奇了……
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显微镜下的世界很精彩！
3楼2011-10-13 11:06:12
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shrimp5555

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

是你的DNA出问题啦？对了，跑胶的时候电压不要太大啊，不然就会出现拖尾的
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大大傻气加上少少耍流氓
4楼2011-10-13 11:09:57
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另一个天堂

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
wanhscn(金币+2): 鼓励应助！ 2011-10-13 12:28:28
树宝宝zyx(金币+2): 2011-10-13 16:20:39
1.空白也有条带，应该是交叉污染了。
2.你的PCR条带不清晰，是不是pcr没扩好？重新做一次（确保加样正确），还是不行的话就换PCR条件，可以自己摸索。一般是
                      95度     5min
                      {95        30s
                    55-57      30s（看你自己的引物）
                     72          1min（看你的DNA大小，一般1kb/min）}  
                      25-35个循环
                      72度     7min
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5楼2011-10-13 11:55:55
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xbl3688

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

树宝宝zyx(金币+2): 2011-10-13 16:20:24
1、连Marker一并出现抹带一般都是电泳的问题，一种可能是电泳液用久了，里边有杂质，建议更换；另一种可能是胶没凝好，配胶时误用水（应用1x TAE）溶解琼脂糖也会出现模糊和抹带；电压稍大没很大关系的，偶尔赶时间130V我都跑过；
2、这图反着看起来真不舒服，你说几次的空白都有条带可能是哪个试剂污染了，或者体系配置有问题。一步一步检查吧。
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生活的乐趣在于善于发现美，学会欣赏美
6楼2011-10-13 12:40:20
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fisheart

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

树宝宝zyx(金币+2): 2011-10-13 16:20:32
空白对照出现条带肯定是里面的通用试剂污染了，建议把正在使用的引物，buffer, Mg+, dNTP全部换成新的， 这些东东用前都分装，出了问题就可以换新的了。

电泳marker跑这样，先检查电泳条件，胶溶解的时候不充分的可能行比较大，化胶的时候摇均匀，确定里面没有小颗粒，是充分溶解了。
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7楼2011-10-13 13:59:52
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树宝宝zyx

新虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by asznpb at 2011-10-13 11:04:12:
1,方向反了，一般习惯都是胶孔在上面
2，从你的marker来看，应该是电泳除了问题
建议更换新的电泳液，重新做胶（琼脂糖浓度高一些，胶硬一些），还有就是降低电压重新跑

刚刚我又做了一个，更换了PCR反应温度，而且用了新买的PCR扩增试剂盒，基本上试剂不太存在污染了，可是跑出来的条带还是这样，空白也有。电泳液才更换没几天，琼脂糖用的1%的，100V跑了35min。我想是不是我提取的DNA有问题呢，那也是我试过很多种方法才试验出来纯度最好的方法啊。。。
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科研真辛苦！
8楼2011-10-13 16:12:06
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asznpb

木虫 (正式写手)
空白有带那肯定是试剂有污染了……胶跑成这样那肯定是电泳体系有问题，marker跑拖尾那就是电泳的问题，没别的原因
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显微镜下的世界很精彩！
9楼2011-10-13 16:24:13
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rollandyoung

金虫 (小有名气)
如果想获得较为理想的电泳条带，建议楼主用宽一点的电泳梳子。
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10楼2011-10-13 16:43:15
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