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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR产物的琼脂糖电泳图片
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hhb7610076

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR产物的琼脂糖电泳图片



这是用3个DNA模板对14对SSR引物的PCR产物的电泳图。
用的是20微升的体系
buffer                   2微升
mg（2.5mM）     2微升
dDTP（2.5mM）  1.5微升
模板                     1微
引物（10um）     上游 1微升
                            下游 1微升
Taq                       1U

退火温度我用的温度范围

为什么同一引物有的出有的不出，麻烦大家帮看一下引物能用吗？
体系还有什么问题。谢谢了！


这是DNA的电泳图。

[ Last edited by hhb7610076 on 2010-12-21 at 09:39 ]
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1楼 2010-12-19 20:29:35
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haitian0625

金虫 (小有名气)
★
hhb7610076(金币+1):谢谢参与
是否应该自己做一下小试，摸一下退火温度呢，合适的退火温度也是PCR的条件之一啊，合适了才可能清晰的，当然不要求产物浓度也无所谓。
不知你模板浓度有多少，模板有些少吧。
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2楼2010-12-19 20:48:11
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★
hhb7610076(金币+1):谢谢参与
图呢楼主？
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3楼2010-12-20 00:09:40
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★
hhb7610076(金币+1):谢谢参与
这么多引物，首先应该用primer等软件看看是否符合做引物的条件，然后再选出合适的来做梯度PCR，确定比较合适的条件。

不知道楼主做这个实验的目的是什么
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4楼2010-12-20 02:50:04
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rechkov

木虫 (正式写手)
★
hhb7610076(金币+1):谢谢参与
我的经验呢，DNA质量对引物的扩增效率是有很大影响的，所以在相通扩增条件下，三个DNA模板的扩增效果是有很大差异的。这里你只说模板是1微升，太不精细了，你应该首先给DNA定量，然后稀释到大约相同的浓度，做SSR一般50到100纳克DNA就够了，太多了有时反而扩增不出来。
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5楼2010-12-20 05:07:37
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)
★
hhb7610076(金币+1):谢谢参与
建议每个模板重复三次
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6楼2010-12-20 08:17:02
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hhb7610076

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by haitian0625 at 2010-12-19 20:48:11:
是否应该自己做一下小试，摸一下退火温度呢，合适的退火温度也是PCR的条件之一啊，合适了才可能清晰的，当然不要求产物浓度也无所谓。
不知你模板浓度有多少，模板有些少吧。

退火温度我用的是温度梯度  模板在50-100 ng之间
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7楼2010-12-20 12:28:04
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hhb7610076

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2010-12-20 00:09:40:
图呢楼主？

有啊
能看见的。。。
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8楼2010-12-20 12:28:55
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hhb7610076

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2010-12-20 02:50:04:
这么多引物，首先应该用primer等软件看看是否符合做引物的条件，然后再选出合适的来做梯度PCR，确定比较合适的条件。

不知道楼主做这个实验的目的是什么

引物是文献上查的，ssr 做遗传多样性的。 不知道产物浓度行不行？
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9楼2010-12-20 12:32:34
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hhb7610076

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-12-20 08:17:02:
建议每个模板重复三次

恩 谢谢
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10楼2010-12-20 12:34:48
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hhb7610076

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by rechkov at 2010-12-20 05:07:37:
我的经验呢，DNA质量对引物的扩增效率是有很大影响的，所以在相通扩增条件下，三个DNA模板的扩增效果是有很大差异的。这里你只说模板是1微升，太不精细了，你应该首先给DNA定量，然后稀释到大约相同的浓度，做SSR ...

现在的产物浓度是不是有点低呢？  那是应该增加模板的量吗？
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11楼2010-12-20 12:37:06
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hhb7610076 at 2010-12-20 12:32:34:


引物是文献上查的，ssr 做遗传多样性的。 不知道产物浓度行不行？

偶，楼主DNA的电泳图么，上来看看啊
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12楼2010-12-20 13:13:24
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haitian0625

金虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by hhb7610076 at 2010-12-20 12:28:55:


有啊
能看见的。。。

我们实验室用很原始的377测序仪就能分型，这样的条带是可以的。
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13楼2010-12-20 13:47:22
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rechkov

木虫 (正式写手)
★
lstt09nk(金币+1):鼓励交流，欢迎常来 2010-12-20 17:06:13
引用回帖:
Originally posted by hhb7610076 at 2010-12-20 12:37:06:


现在的产物浓度是不是有点低呢？  那是应该增加模板的量吗？

产物浓度低并不一定是模板浓度低造成的，根据我的经验，有时候模板浓度过高反而会造成产量降低，所以还是建议你测一下模板浓度，或者做一个梯度试验，看看多大浓度才适合。
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14楼2010-12-20 16:41:21
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hhb7610076

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by rechkov at 2010-12-20 16:41:21:


产物浓度低并不一定是模板浓度低造成的，根据我的经验，有时候模板浓度过高反而会造成产量降低，所以还是建议你测一下模板浓度，或者做一个梯度试验，看看多大浓度才适合。

我测过一次浓度 好像是因为不纯 没测出准确的值。
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15楼2010-12-21 09:44:21
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hhb7610076

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by rioarsenal at 2010-12-20 13:13:24:



偶，楼主DNA的电泳图么，上来看看啊

图上了！
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16楼2010-12-21 09:44:43
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rioarsenal

金虫 (正式写手)
★ ★
rainwander(金币+2):鼓励新虫积极参与~~~ 2010-12-22 08:11:35
引用回帖:
Originally posted by hhb7610076 at 2010-12-21 09:44:43:


图上了！

模板DNA质量一般，建议好好纯化下，然后适当增加模板用量
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17楼2010-12-22 05:26:00
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tanxi125

银虫 (小有名气)
★
hhb7610076(金币+1):谢谢参与
给我跑的一样，开始点样指点了5μl，现在我都点上了，才比较亮，你再多扩几次，越扩就越好，模板我的是1μg/μl的DNA母液，稀释十倍后，在20μl体系里面加入1μl。
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18楼2011-01-07 12:23:13
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
★
hhb7610076(金币+1):谢谢参与
是啊   什么目的呢
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19楼2011-01-17 21:30:50
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千与千寻oO

铁虫 (小有名气)
★
hhb7610076(金币+1):谢谢参与
看了所有的回帖。感觉上应该是你的DNA的质量问题。如果条件允许的话，可以测下DNA的OD值。我也做多样性，一般浓度在100纳克左右。然后A260/280=1.8~2.0，A260/230＞2就说明DNA质量很好。
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20楼2011-04-01 13:15:07
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dingxiuying

木虫 (正式写手)
★
hhb7610076(金币+1):谢谢参与
我也在学习做ssr，楼主的pcr产物电泳图是不是表明特异性太差了，ssr引物扩增出的产物不应该有那么多条带吧？希望有经验的同行给做个指点。谢谢先。
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21楼2011-04-02 17:15:04
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niuzheng

银虫 (小有名气)
★
hhb7610076(金币+1):谢谢参与
有没有人能把结果分析一下，不要讲那个退火温度。还有这个结果能简单的说明什么问题吗？
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22楼2011-10-23 18:56:19
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dingxiuying

木虫 (正式写手)
1、感觉DNA提的质量不好。
2、引物应该不会有问题，因为都是网上查到的现成的。
3、PCR产物的特异性不好，建议提高退火温度。
4、我用的模板是150ng，效果不错。
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23楼2011-10-24 09:03:36
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dingxiuying

木虫 (正式写手)
引用回帖:
22楼: Originally posted by niuzheng at 2011-10-23 18:56:19:
有没有人能把结果分析一下，不要讲那个退火温度。还有这个结果能简单的说明什么问题吗？

电泳的结果结合资料中PCR产物的长度可以大概判断出ssr引物是否具有多态性。但是PCR条件的优化是必须要做的，因为这是以后试验的基础。
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24楼2011-10-24 09:06:51
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wxq999

新虫 (小有名气)
西瓜:编辑内容 2011-10-24 17:49
-------------广告内容-----------------
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[ Last edited by 西瓜 on 2011-10-24 at 17:49 ]
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25楼2011-10-24 17:01:18
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冬天小和尚

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
三个DNA模板是来自同一个个体的吗？如果不是，那是会有差异的吧？
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26楼2011-12-12 15:21:56
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btx362237729

金虫 (正式写手)
哇 好大的胶
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27楼2011-12-13 01:39:18
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三吉之一28楼
2013-09-12 10:47   回复  
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