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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 两种引物的PCR电泳图，做了多次还是不解
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树宝宝zyx

新虫 (小有名气)

[求助] 两种引物的PCR电泳图，做了多次还是不解

下面我的PCR电泳图，彩色图第一个是Marker，诚然Marker跑得不好，买来直接用，可是每次都跑不开。
    因为我做的是T-RFLP即末端限制性酶切技术，所以用的是带荧光的引物，选择时我参考的文献人家也选择的这样的，P出的片段大约是1.5KB，左起第2,3个是DNA的PCR，4,5是空白，可是为什么有条带，做了很多次都这样。后面四个是用另一种引物做的，不带荧光，P出的片段是100多bp，靠右边两个是空白。
   不知道有没有人也是做T-RFLP的，能否传授些宝贵经验，后面就是要切割胶片进行纯化，然后对PCR产物进行酶切，可是PCR这是做不好，下面一直无法进行下去。
  附上之前做过的黑白图，用的是带荧光的引物做的，每次都呈现这样的图，之前我也没观察颜色的不同，一直解不开谜团。这样分析的话是不是跑得比较慢的是我需要的片段呢，如何去除不需要的荧光片段呢？







[ Last edited by 树宝宝zyx on 2011-10-16 at 12:30 ]
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科研真辛苦！
1楼 2011-10-16 12:13:59
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
树宝宝zyx(金币+5): 2011-10-16 20:01:19
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 分析很有条理！ 2011-10-16 23:56:25
1.胶可能没凝好
2.电泳液该换了
3.你的电泳液和你的溶胶的缓冲液是不是一个体系
4.还有就是你可以稍稍提高下琼脂糖的浓度。。。
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2011-10-16 14:39:03
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普通回帖

hdengmin

木虫 (著名写手)
没做过T-RFLP
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2楼2011-10-16 12:49:29
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doublehelix

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
树宝宝zyx(金币+3): 2011-10-16 20:01:09
西瓜(金币+2): good 2011-10-16 23:48:46
如果marker跑的都不清楚，还是建议LZ先弄清电泳问题出在哪？再来分析自己的样品，问题一步步来排除.......marker这么模糊，感觉凝胶配置有问题 ，电泳缓冲液与配胶缓冲液是否一致呢 ？
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3楼2011-10-16 13:58:56
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by doublehelix at 2011-10-16 13:58:56:
如果marker跑的都不清楚，还是建议LZ先弄清电泳问题出在哪？再来分析自己的样品，问题一步步来排除.......marker这么模糊，感觉凝胶配置有问题 ，电泳缓冲液与配胶缓冲液是否一致呢 ？

和楼上一样的建议
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4楼2011-10-16 14:33:43
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liukgg

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
树宝宝zyx(金币+2): 2011-10-16 20:01:40
西瓜(金币+2): 第一次听说，学习了！ 2011-10-16 23:56:02
除了楼上的建议外，将胶后染试一下，染色剂可能对DNA的构象有影响
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山水凤凰
6楼2011-10-16 18:32:05
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大孙20111987

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

树宝宝zyx(金币+2): 2011-10-16 20:01:34
建议楼主换一个电泳仪试试
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做好自己，坚持到底
7楼2011-10-16 18:59:08
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rfengyi

禁虫 (正式写手)
树宝宝zyx(金币+3): 2011-10-17 12:50:30
本帖内容被屏蔽
8楼2011-10-17 09:34:35
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树宝宝zyx

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by rfengyi at 2011-10-17 09:34:35:
空白有东西会不会是有DNA污染，特别是水，尝试用新灭的水做空白对照。从电泳结果看，有拖带，你的PCR条件再优化一下。做胶的缓冲液要新鲜的，至少不要放了一个星期的，跑胶的电泳液是不是用了很久没换？

电泳液是配的50倍的保存在4°C冰箱，需要的时候稀释了再用的。不过那个配了倒是有2个多月了，是不是有关系呢。制胶和电泳液下次我尽量用统一配的，有时候不是同一次配的可能浓度稍有不同。下面是我新做的PCR，用的都是一样的引物。自左起前两个是空白，接下来四个是用降落式的温度。第7,8是两个空白，最后四个是恒温循环。94°C，3min；94°C   45s，54°C 30S，72°C 1min；72°C 10min。看着应该是恒温条件效果好，不知道这个拖尾问题如何解决。而且空白总是有条带。。。东西我都是新近买的，自从买来以后开始做就从来都是有条带，都不知道为什么。。
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科研真辛苦！
9楼2011-10-17 12:49:46
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jjxcz

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
wanhscn(金币+1): 鼓励应助回帖 2011-10-18 18:41:09
引用回帖:
9楼: Originally posted by 树宝宝zyx at 2011-10-17 12:49:46:
电泳液是配的50倍的保存在4°C冰箱，需要的时候稀释了再用的。不过那个配了倒是有2个多月了，是不是有关系呢。制胶和电泳液下次我尽量用统一配的，有时候不是同一次配的可能浓度稍有不同。下面是我新做的PCR，用 ...

新买来的东西都有条带？可以考虑下是不是空气污染，建议换一下实验地点。
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10楼2011-10-17 13:02:11
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