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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】做过大引物全质粒PCR的进来看
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wgl365

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】做过大引物全质粒PCR的进来看

最近在做大引物全质粒PCR以构建随机突变文库，参考的文献是Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP)
作者：Kentaro Miyazaki。文章出自Directed Evolution Library Creation：methods and protocols  （Methods in Molecular Biology, 2003, Volume 231, I, 23-28, DOI: 10.1385/1-59259-395-X:23 ） ，此外还有一篇文章Creating random mutagenesis libraries using megaprimer PCR of whole plasmid，作者：Miyazaki K, Takenouchi ，文章出自.Biotechniques. 2002 Nov;33(5):1033-4, 1036-8.

这里我是用易错PCR的产物做大引物，易错PCR回收电泳图如1所示，用的是2000的marker，易错PCR产物在1000bp左右，这个没什么问题，可是在大引物PCr结果如图2所示，我的目标质粒是7K，两边为marker，一个5000，一个10000，中间两个是结果，求解，为什么加样孔处一片亮而没有我的目的带，照道理即便条件没有优化至少也该有目的为7K的带吧。凝胶凝固后放的时间有点长了，跑的结果不好。
我大引物PCr用的是Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase,浓度：2.5U/uL，pcr的反应体系总计50uL：其中大引物约0.5ug，模版DNA50ng，0.2mM的dNTP，PrimeSTAR HS DNA Polymerase用0.5ul，也就是1.25U，我的目标质粒是7K，PCR反应程序：98 ℃，1min——98℃，10s——55℃，5s——72℃，7min——72℃，7min——4℃保存（基本按酶的使用说明书进行）。反应共20个循环，求高人解答为什么会变成这个样子。
图1-易错PCR产物回收

图2-大引物PCR结果


[ Last edited by wgl365 on 2010-8-31 at 20:44 ]
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思想是行动的种子！
1楼 2010-08-31 20:38:18
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wgl365

银虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by tete1987 at 2013-12-26 13:04:40
点饱和突变，用的是小引物，很好P的。
大引物易错PCR，这个用的是长片段当引物，不太好P。但是按照文献的方法能够扩增出来。我已经转化了，能长很多，比酶切连接的效率高多了。...

饱和突变还好，呵呵
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思想是行动的种子！
16楼2014-01-02 22:36:10
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wgl365

银虫 (小有名气)
引用回帖:
18楼: Originally posted by tete1987 at 2014-01-03 10:37:16
点错了，不小心赞了。。
是饱和突变，跟单点突变也没什么差别吧，就是工作量大了点...

徐岩老师那里吗？还是陈坚校长？
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思想是行动的种子！
20楼2014-01-04 11:22:13
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普通回帖

cleb

铁杆木虫 (正式写手)
wgl365(金币+1):沙发奖励 2010-09-01 18:02:01
不懂哦
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2楼2010-08-31 20:40:21
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xiangshengyan

木虫 (正式写手)
wgl365(金币+1):感谢顶帖 2010-08-31 21:04:23
我觉得没跑开 你的PCR还是成功的 7K很大了 不知道你的胶的浓度时多少
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ANNA&KEVIN
3楼2010-08-31 20:52:55
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wgl365

银虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by xiangshengyan at 2010-08-31 20:52:55:
我觉得没跑开 你的PCR还是成功的 7K很大了 不知道你的胶的浓度时多少

1%的琼脂糖凝胶，不是7k太大的原因，10000的marker都能跑开，平时我们跑毕赤酵母的pPIC9k也是这个浓度，都能跑开
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思想是行动的种子！
4楼2010-08-31 21:03:56
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
wgl365(金币+5):呵呵，试试 2010-10-05 19:40:08
又是你啊。不知你实验怎么样，刚看到你的求助。
我的建议：
1.不要用primerstar,用Pfu.
2酶量50微升体系要加1u的酶，因为P的时间比较长。
3程序按照文献的程序
GOOD LUCK
别忘给我金币
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仕不可不弘毅，任重而道远
5楼2010-10-04 21:43:10
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newrqi

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
TMD，跟我的结果一模一样
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6楼2012-09-25 21:08:11
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wyf625356

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
最近也在做大引物全质粒PCR，遇到了类似的情况，请问楼主当时是怎么解决这个问题的
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7楼2012-12-14 09:26:24
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saimintc

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
跑了N遍大引物，同文啊
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8楼2013-05-07 16:45:08
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tete1987

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
我现在也在做全质粒PCR构建文库，用的跟你相同的条件。今天刚做完第二步PCR，点了8ul，能够看见条带。
我觉得这种方法应该P不出来很亮的质粒条带；
质粒很大，电泳看大小不准确；
所以楼主可以多点写样品看一下，能看到一点条带就可以做转化；
具体结果要以转化出来为准。
今天晚上做转化，转化出来结果再告诉你。
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嘿嘿，just for you~
9楼2013-12-20 16:22:05
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wgl365

银虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by tete1987 at 2013-12-20 16:22:05
我现在也在做全质粒PCR构建文库，用的跟你相同的条件。今天刚做完第二步PCR，点了8ul，能够看见条带。
我觉得这种方法应该P不出来很亮的质粒条带；
质粒很大，电泳看大小不准确；
所以楼主可以多点写样品看一下， ...

呵呵，你做点饱和突变么？
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思想是行动的种子！
10楼2013-12-24 10:27:11
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