24小时热门版块排行榜

返回列表

当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

wgl365

银虫 (小有名气)

应助: 4 (幼儿园)
金币: 281.9
散金: 15
红花: 2
帖子: 225
在线: 94.7小时
虫号: 409630
注册: 2007-06-22
性别: GG
专业: 生物大分子结构与功能

[交流] 【求助/交流】做过大引物全质粒PCR的进来看

最近在做大引物全质粒PCR以构建随机突变文库，参考的文献是Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP)
作者：Kentaro Miyazaki。文章出自Directed Evolution Library Creation：methods and protocols （Methods in Molecular Biology, 2003, Volume 231, I, 23-28, DOI: 10.1385/1-59259-395-X:23 ），此外还有一篇文章Creating random mutagenesis libraries using megaprimer PCR of whole plasmid，作者：Miyazaki K, Takenouchi ，文章出自.Biotechniques. 2002 Nov;33(5):1033-4, 1036-8.

这里我是用易错PCR的产物做大引物，易错PCR回收电泳图如1所示，用的是2000的marker，易错PCR产物在1000bp左右，这个没什么问题，可是在大引物PCr结果如图2所示，我的目标质粒是7K，两边为marker，一个5000，一个10000，中间两个是结果，求解，为什么加样孔处一片亮而没有我的目的带，照道理即便条件没有优化至少也该有目的为7K的带吧。凝胶凝固后放的时间有点长了，跑的结果不好。
我大引物PCr用的是Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase,浓度：2.5U/uL，pcr的反应体系总计50uL：其中大引物约0.5ug，模版DNA50ng，0.2mM的dNTP，PrimeSTAR HS DNA Polymerase用0.5ul，也就是1.25U，我的目标质粒是7K，PCR反应程序：98 ℃，1min——98℃，10s——55℃，5s——72℃，7min——72℃，7min——4℃保存（基本按酶的使用说明书进行）。反应共20个循环，求高人解答为什么会变成这个样子。
图1-易错PCR产物回收

图2-大引物PCR结果

[ Last edited by wgl365 on 2010-8-31 at 20:44 ]

回复此楼

» 猜你喜欢

为什么蛋白质氨基酸测定大家都测17种? 已经有5人回复
《灰分记：我与坩埚的“灰烬”之恋》已经有3人回复
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费? 已经有241人回复
求助食品检验工（基础知识），中国劳动社会出版社电子版已经有5人回复
胶体几丁质的结晶度？已经有0人回复
诚挚招收全日制博士！！！中国农业科学院麻类研究所谭志坚研究员课题组招收博士已经有2人回复
三甲基羟乙基丙二胺的合成路线已经有5人回复

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

pcr产物电泳图已经有14人回复
含高级结构的质粒PCR 已经有5人回复
质粒PCR用来验证阳性的可靠性已经有18人回复
求助质粒pRK2013和质粒pRK4013的质粒图谱已经有8人回复
求大虫帮忙看看通用引物PCR跑胶结果已经有11人回复
大家做pcr的酶引物模板从冰箱里拿出来是怎么融化的啊已经有20人回复
关于PCR整个质粒的问题已经有7人回复
质粒PCR后琼脂糖凝胶电泳结果问题已经有7人回复
关于质粒的PCR 已经有5人回复
求 pT7-7质粒图谱已经有5人回复
能不能只用一条引物做不对称PCR？已经有11人回复
求助：约6kb质粒做模板的pcr程序怎么设定啊已经有12人回复
PCR扩增法制备低拷贝质粒（替代常规质粒提取）已经有11人回复
细菌引物 338F 518R 做DGGE之后 pcr 已经有9人回复
帮忙评价一下PCR引物已经有11人回复
全质粒PCR引物设计已经有9人回复
可以环形质粒直接做模板吗已经有8人回复
做过overlap PCR的虫子过来看看已经有19人回复
两种引物的PCR电泳图，做了多次还是不解已经有18人回复
pHT304质粒的全序列已经有4人回复
【求助/交流】质粒PCR产物的回收（质粒构建）已经有11人回复
【求助/交流】做连接后的质粒是否可以用来做pcr 已经有10人回复
【求助/交流】求助PCR-Targeting抗性基因质粒已经有5人回复
【分享】免费共享----Real-Time PCR引物，从老鼠到人，应有尽有已经有28人回复

思想是行动的种子！

1楼2010-08-31 20:38:18

已阅回复此楼关注TA 给TA发消息送TA红花 TA的回帖

wgl365

银虫 (小有名气)

应助: 4 (幼儿园)
金币: 281.9
散金: 15
红花: 2
帖子: 225
在线: 94.7小时
虫号: 409630
注册: 2007-06-22
性别: GG
专业: 生物大分子结构与功能

引用回帖:

9楼: Originally posted by tete1987 at 2013-12-20 16:22:05
我现在也在做全质粒PCR构建文库，用的跟你相同的条件。今天刚做完第二步PCR，点了8ul，能够看见条带。
我觉得这种方法应该P不出来很亮的质粒条带；
质粒很大，电泳看大小不准确；
所以楼主可以多点写样品看一下， ...

呵呵，你做点饱和突变么？