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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】质粒PCR产物的回收（质粒构建）
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】质粒PCR产物的回收（质粒构建）

现在在做质粒的构建，将原来质粒的营养缺陷标记去除，再连接抗性标记到质粒上， 目前质粒PCR已经能够有正确的产物扩增，大小为7Kb左右,现在问题是用了国产某公司的离心柱型的琼脂糖凝胶回收试剂盒做了四次没有任何片段，想请教一下各位虫友是不是用玻璃奶的方法更好一点。
  再就是不知道离心速度会不会剪切质粒载体。  谢谢各位帮忙！
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1楼 2011-01-12 15:35:07
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)
★
rainwander(金币+1):鼓励积极参与交流~~~ 2011-01-12 15:58:41
xtcao668(金币+1): 2011-01-12 16:26:14
Axygene的回收KIT用着不错的。片段越长越容易别剪切力打断。
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2楼2011-01-12 15:46:08
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)
我打算买MBI的凝胶回收试剂盒试试，他们是玻璃奶方法回收的
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3楼2011-01-12 16:26:57
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天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★
xtcao668(金币+1): 2011-01-12 17:10:00
dhd997(金币+2): 谢谢交流 2011-01-18 09:01:56
你的意思是纯化试剂盒吧？纯化出来没有东西？很有可能是你的回收率太低了，可以纯化以后多点些样，原因呢:

1:试剂盒的问题
2：你最终的纯化体积太大了，我们一般是20ul左右
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4楼2011-01-12 16:37:17
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)
试剂盒推荐最少的洗脱体积是40ul, 我还做了NaAC 乙醇沉淀 均无回收产物。
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5楼2011-01-12 17:07:40
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)
我回收体积PCR做到了100ul，通常只用50就可以了。 所以感觉是试剂盒的问题，想请教一下有没有人做过这方面实验研究。 谢谢
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6楼2011-01-12 17:09:53
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xiangyunch

金虫 (小有名气)
xtcao668(金币+1): 2011-01-15 23:46:23
换试剂盒试试吧 我们这边十几Kb的回收效果都很好，在溶胶后加入异丙醇试试。
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7楼2011-01-15 19:21:13
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xtcao668

至尊木虫 (著名写手)
加异丙醇作用是什么？
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8楼2011-01-15 23:47:07
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wuw579

铁杆木虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1): 谢谢交流 2011-01-18 09:03:58
加入异丙醇是为了更好的沉淀DNA
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9楼2011-01-17 20:48:05
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QIAO4984

铜虫 (小有名气)
★
dhd997(金币+1): 感谢经验交流 2011-01-18 09:04:22
我觉得 是盒子的  问题


用promega 凝胶回收
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10楼2011-01-17 23:41:41
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 谢谢交流 2011-01-18 09:03:26
xtcao668(金币+1): 2011-01-19 10:26:14
我觉得这种DNA相关回收类的试剂盒还是Qiagen的比较靠谱，国产的天根也还可以接受，但收的效率明显没Qiagen的好，柱子回收的效果确实不太好。
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11楼2011-01-18 09:01:15
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dhd997

荣誉版主 (文坛精英)
xtcao668(金币+1): 2011-01-19 10:26:18
引用回帖:
Originally posted by xtcao668 at 2011-01-12 17:09:53:
我回收体积PCR做到了100ul，通常只用50就可以了。 所以感觉是试剂盒的问题，想请教一下有没有人做过这方面实验研究。 谢谢

楼主可以把所有问题，在一楼编辑，也可以引用回复，方便虫友看到，及时回答你的问题。
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12楼2011-01-18 09:03:01
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