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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 含高级结构的质粒PCR
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yll232

铁虫 (初入文坛)

[求助] 含高级结构的质粒PCR

我们通过T4连接酶将两个片段连接一个质粒，转化后涂板，挑取一个菌落培养后将菌液送测序，返回结果说有高级结构，我想问一下所谓的高级结构影响我对这个质粒PCR吗？谢谢了
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1楼2013-01-15 09:36:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yll232: 金币+2, ★有帮助 2013-01-15 14:57:41
可能会的。比方说有重复序列形成发卡结构什么的，做PCR退火时可能影响引物与模板结合，延伸时也可能造成困难或错误。
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2楼2013-01-15 09:42:18
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-01-15 11:51:33
测序说的高级结构可能是GC含量高，或者是序列中单碱基重复多次（如连续10个T），这样会导致测序测不通。至于PCR，不知道你的目的片段有多大，如果小于1000bp的话，先用普通的Taq酶和普通buffer做一次，看看结果。如果不理想的话，改用GCbuffer做，应该不会有大问题的。
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3楼2013-01-15 09:53:17
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yll232

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yesali at 2013-01-15 09:53:17
测序说的高级结构可能是GC含量高，或者是序列中单碱基重复多次（如连续10个T），这样会导致测序测不通。至于PCR，不知道你的目的片段有多大，如果小于1000bp的话，先用普通的Taq酶和普通buffer做一次，看看结果。如 ...

谢谢，质粒大小是2200个bp，也只能做做看了
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4楼2013-01-15 15:01:02
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yll232

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-15 09:42:18
可能会的。比方说有重复序列形成发卡结构什么的，做PCR退火时可能影响引物与模板结合，延伸时也可能造成困难或错误。

那怎么解决呢  这个质粒是我们连接得来的 按说不应该出现高级结构才对啊
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5楼2013-01-15 15:02:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
5楼: Originally posted by yll232 at 2013-01-15 15:02:38
那怎么解决呢  这个质粒是我们连接得来的 按说不应该出现高级结构才对啊...

你先自己做一下PCR看看是否没有问题。不行的话建议使用GC-RICH模板buffer。
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6楼2013-01-15 16:04:25
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