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yll232

铁虫 (初入文坛)

[求助] 含高级结构的质粒PCR

我们通过T4连接酶将两个片段连接一个质粒,转化后涂板,挑取一个菌落培养后将菌液送测序,返回结果说有高级结构,我想问一下所谓的高级结构影响我对这个质粒PCR吗?谢谢了
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
yll232: 金币+2, 有帮助 2013-01-15 14:57:41
可能会的。比方说有重复序列形成发卡结构什么的,做PCR退火时可能影响引物与模板结合,延伸时也可能造成困难或错误。
2楼2013-01-15 09:42:18
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yesali

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-01-15 11:51:33
测序说的高级结构可能是GC含量高,或者是序列中单碱基重复多次(如连续10个T),这样会导致测序测不通。至于PCR,不知道你的目的片段有多大,如果小于1000bp的话,先用普通的Taq酶和普通buffer做一次,看看结果。如果不理想的话,改用GCbuffer做,应该不会有大问题的。
3楼2013-01-15 09:53:17
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yll232

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
3楼: Originally posted by yesali at 2013-01-15 09:53:17
测序说的高级结构可能是GC含量高,或者是序列中单碱基重复多次(如连续10个T),这样会导致测序测不通。至于PCR,不知道你的目的片段有多大,如果小于1000bp的话,先用普通的Taq酶和普通buffer做一次,看看结果。如 ...

谢谢,质粒大小是2200个bp,也只能做做看了
4楼2013-01-15 15:01:02
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yll232

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-01-15 09:42:18
可能会的。比方说有重复序列形成发卡结构什么的,做PCR退火时可能影响引物与模板结合,延伸时也可能造成困难或错误。

那怎么解决呢  这个质粒是我们连接得来的 按说不应该出现高级结构才对啊
5楼2013-01-15 15:02:38
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

引用回帖:
5楼: Originally posted by yll232 at 2013-01-15 15:02:38
那怎么解决呢  这个质粒是我们连接得来的 按说不应该出现高级结构才对啊...

你先自己做一下PCR看看是否没有问题。不行的话建议使用GC-RICH模板buffer。
6楼2013-01-15 16:04:25
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