| 查看: 4271 | 回复: 29 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
【求助/交流】做过大引物全质粒PCR的进来看
|
|||
|
最近在做大引物全质粒PCR以构建随机突变文库，参考的文献是Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP) 作者：Kentaro Miyazaki。文章出自Directed Evolution Library Creation：methods and protocols （Methods in Molecular Biology, 2003, Volume 231, I, 23-28, DOI: 10.1385/1-59259-395-X:23 ） ，此外还有一篇文章Creating random mutagenesis libraries using megaprimer PCR of whole plasmid，作者：Miyazaki K, Takenouchi ，文章出自.Biotechniques. 2002 Nov;33(5):1033-4, 1036-8. 这里我是用易错PCR的产物做大引物，易错PCR回收电泳图如1所示，用的是2000的marker，易错PCR产物在1000bp左右，这个没什么问题，可是在大引物PCr结果如图2所示，我的目标质粒是7K，两边为marker，一个5000，一个10000，中间两个是结果，求解，为什么加样孔处一片亮而没有我的目的带，照道理即便条件没有优化至少也该有目的为7K的带吧。凝胶凝固后放的时间有点长了，跑的结果不好。 我大引物PCr用的是Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase,浓度：2.5U/uL，pcr的反应体系总计50uL：其中大引物约0.5ug，模版DNA50ng，0.2mM的dNTP，PrimeSTAR HS DNA Polymerase用0.5ul，也就是1.25U，我的目标质粒是7K，PCR反应程序：98 ℃，1min——98℃，10s——55℃，5s——72℃，7min——72℃，7min——4℃保存（基本按酶的使用说明书进行）。反应共20个循环，求高人解答为什么会变成这个样子。 图1-易错PCR产物回收  图2-大引物PCR结果  [ Last edited by wgl365 on 2010-8-31 at 20:44 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有68人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- pcr产物电泳图
已经有14人回复
- 含高级结构的质粒PCR
已经有5人回复
- 质粒PCR用来验证阳性的可靠性
已经有18人回复
- 求助质粒pRK2013和质粒pRK4013的质粒图谱
已经有8人回复
- 求大虫帮忙看看通用引物PCR跑胶结果
已经有11人回复
- 大家做pcr的酶引物 模板从冰箱里拿出来是怎么融化的啊
已经有20人回复
- 关于PCR整个质粒的问题
已经有7人回复
- 质粒PCR后琼脂糖凝胶电泳结果问题
已经有7人回复
- 关于质粒的PCR
已经有5人回复
- 求 pT7-7质粒图谱
已经有5人回复
- 能不能只用一条引物做不对称PCR？
已经有11人回复
- 求助：约6kb质粒做模板的pcr程序怎么设定啊
已经有12人回复
- PCR扩增法制备低拷贝质粒（替代常规质粒提取）
已经有11人回复
- 细菌引物 338F 518R 做DGGE之后 pcr
已经有9人回复
- 帮忙评价一下PCR引物
已经有11人回复
- 全质粒PCR引物设计
已经有9人回复
- 可以环形质粒直接做模板吗
已经有8人回复
- 做过overlap PCR的虫子过来看看
已经有19人回复
- 两种引物的PCR电泳图，做了多次还是不解
已经有18人回复
- pHT304质粒的全序列
已经有4人回复
- 【求助/交流】质粒PCR产物的回收（质粒构建）
已经有11人回复
- 【求助/交流】做连接后的质粒是否可以用来做pcr
已经有10人回复
- 【求助/交流】求助PCR-Targeting抗性基因质粒
已经有5人回复
- 【分享】免费共享----Real-Time PCR引物，从老鼠到人，应有尽有
已经有28人回复
xiangshengyan
木虫 (正式写手)
- 应助: 2 (幼儿园)
- 贵宾: 0.35
- 金币: 4075.7
- 红花: 1
- 帖子: 523
- 在线: 88.1小时
- 虫号: 30691
- 注册: 2003-12-03
- 性别: GG
- 专业: 生物大分子结构与功能
3楼2010-08-31 20:52:55
4楼2010-08-31 21:03:56
墨香若水
木虫 (著名写手)
小小囧虫
- 应助: 15 (小学生)
- 金币: 3059.1
- 散金: 942
- 红花: 10
- 沙发: 1
- 帖子: 1408
- 在线: 255.2小时
- 虫号: 528502
- 注册: 2008-03-19
- 性别: GG
- 专业: 生物化学
GOOD LUCK
5楼2010-10-04 21:43:10
6楼2012-09-25 21:08:11
5