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wgl365

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】做过大引物全质粒PCR的进来看

最近在做大引物全质粒PCR以构建随机突变文库，参考的文献是Creating Random Mutagenesis Libraries by Megaprimer PCR of Whole Plasmid (MEGAWHOP)
作者：Kentaro Miyazaki。文章出自Directed Evolution Library Creation：methods and protocols  （Methods in Molecular Biology, 2003, Volume 231, I, 23-28, DOI: 10.1385/1-59259-395-X:23 ） ，此外还有一篇文章Creating random mutagenesis libraries using megaprimer PCR of whole plasmid，作者：Miyazaki K, Takenouchi ，文章出自.Biotechniques. 2002 Nov;33(5):1033-4, 1036-8.

这里我是用易错PCR的产物做大引物，易错PCR回收电泳图如1所示，用的是2000的marker，易错PCR产物在1000bp左右，这个没什么问题，可是在大引物PCr结果如图2所示，我的目标质粒是7K，两边为marker，一个5000，一个10000，中间两个是结果，求解，为什么加样孔处一片亮而没有我的目的带，照道理即便条件没有优化至少也该有目的为7K的带吧。凝胶凝固后放的时间有点长了，跑的结果不好。
我大引物PCr用的是Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase,浓度：2.5U/uL，pcr的反应体系总计50uL：其中大引物约0.5ug，模版DNA50ng，0.2mM的dNTP，PrimeSTAR HS DNA Polymerase用0.5ul，也就是1.25U，我的目标质粒是7K，PCR反应程序：98 ℃，1min——98℃，10s——55℃，5s——72℃，7min——72℃，7min——4℃保存（基本按酶的使用说明书进行）。反应共20个循环，求高人解答为什么会变成这个样子。
图1-易错PCR产物回收

图2-大引物PCR结果


[ Last edited by wgl365 on 2010-8-31 at 20:44 ]
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思想是行动的种子！
1楼 2010-08-31 20:38:18
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cleb

铁杆木虫 (正式写手)
wgl365(金币+1):沙发奖励 2010-09-01 18:02:01
不懂哦
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2楼2010-08-31 20:40:21
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