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汕头大学海洋科学接受调剂
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树宝宝zyx

新虫 (小有名气)

[求助] 两种引物的PCR电泳图,做了多次还是不解

下面我的PCR电泳图,彩色图第一个是Marker,诚然Marker跑得不好,买来直接用,可是每次都跑不开。
    因为我做的是T-RFLP即末端限制性酶切技术,所以用的是带荧光的引物,选择时我参考的文献人家也选择的这样的,P出的片段大约是1.5KB,左起第2,3个是DNA的PCR,4,5是空白,可是为什么有条带,做了很多次都这样。后面四个是用另一种引物做的,不带荧光,P出的片段是100多bp,靠右边两个是空白。
   不知道有没有人也是做T-RFLP的,能否传授些宝贵经验,后面就是要切割胶片进行纯化,然后对PCR产物进行酶切,可是PCR这是做不好,下面一直无法进行下去。
  附上之前做过的黑白图,用的是带荧光的引物做的,每次都呈现这样的图,之前我也没观察颜色的不同,一直解不开谜团。这样分析的话是不是跑得比较慢的是我需要的片段呢,如何去除不需要的荧光片段呢?







[ Last edited by 树宝宝zyx on 2011-10-16 at 12:30 ]
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科研真辛苦!
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树宝宝zyx

新虫 (小有名气)

引用回帖:
8楼: Originally posted by rfengyi at 2011-10-17 09:34:35:
空白有东西会不会是有DNA污染,特别是水,尝试用新灭的水做空白对照。从电泳结果看,有拖带,你的PCR条件再优化一下。做胶的缓冲液要新鲜的,至少不要放了一个星期的,跑胶的电泳液是不是用了很久没换?

电泳液是配的50倍的保存在4°C冰箱,需要的时候稀释了再用的。不过那个配了倒是有2个多月了,是不是有关系呢。制胶和电泳液下次我尽量用统一配的,有时候不是同一次配的可能浓度稍有不同。下面是我新做的PCR,用的都是一样的引物。自左起前两个是空白,接下来四个是用降落式的温度。第7,8是两个空白,最后四个是恒温循环。94°C,3min;94°C   45s,54°C 30S,72°C 1min;72°C 10min。看着应该是恒温条件效果好,不知道这个拖尾问题如何解决。而且空白总是有条带。。。东西我都是新近买的,自从买来以后开始做就从来都是有条带,都不知道为什么。。


科研真辛苦!
9楼2011-10-17 12:49:46
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查看全部 19 个回答

doublehelix

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
树宝宝zyx(金币+3): 2011-10-16 20:01:09
西瓜(金币+2): good 2011-10-16 23:48:46
如果marker跑的都不清楚,还是建议LZ先弄清电泳问题出在哪?再来分析自己的样品,问题一步步来排除.......marker这么模糊,感觉凝胶配置有问题 ,电泳缓冲液与配胶缓冲液是否一致呢 ?
3楼2011-10-16 13:58:56
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ganchao1776

至尊木虫 (职业作家)

引用回帖:
3楼: Originally posted by doublehelix at 2011-10-16 13:58:56:
如果marker跑的都不清楚,还是建议LZ先弄清电泳问题出在哪?再来分析自己的样品,问题一步步来排除.......marker这么模糊,感觉凝胶配置有问题 ,电泳缓冲液与配胶缓冲液是否一致呢 ?

和楼上一样的建议
4楼2011-10-16 14:33:43
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mamadexiao

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
树宝宝zyx(金币+5): 2011-10-16 20:01:19
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 分析很有条理! 2011-10-16 23:56:25
1.胶可能没凝好
2.电泳液该换了
3.你的电泳液和你的溶胶的缓冲液是不是一个体系
4.还有就是你可以稍稍提高下琼脂糖的浓度。。。
5楼2011-10-16 14:39:03
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