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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】PCR引物设计出来了，但酶切之后电泳没条带啊
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hutingting

银虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】PCR引物设计出来了，但酶切之后电泳没条带啊 已有10人参与

这是我设计的引物，前引物：5-GGG AAA TCT AGA CTC GTA GTA TCG GTT G-3其中TCT AGA是酶切位点，后引物：5-GG GTT GAT  CAG GAT CCC GTG -3，其中GGATCC是酶切位点，我的序列中包括酶切位点，PCR之后，琼脂糖凝胶电泳的条带很弱，再做酶切之后，就没有条带了，我是做PCR之后，酶切，连接，做感受态细胞的转化，请教各位高手是不是我引物设计的有问题，谢谢啦
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1楼 2010-06-22 10:08:51
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lly198784

木虫 (正式写手)
★
hutingting(金币+3):谢谢参与
应该不是引物的问题，因为你PCR出来了，看看是不是PCR体系的问题！
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2楼2010-06-22 11:22:08
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buster

新虫 (初入文坛)
★
hutingting(金币+3):谢谢参与
会不会是酶切的问题呢。pcr之后条带很弱，酶切体系控制不好的话，没有条带很正常呢。为什么不多P几管合一起纯化后再酶切呢
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3楼2010-06-22 11:56:00
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ququr008

金虫 (小有名气)
★ ★
hutingting(金币+3):谢谢参与
lstt09nk(金币+1):很热心~~ 2010-06-22 13:57:43
你需要解决如下几个问题：1、带是否确信是你需要的条带？巢式PCR可以确认。2、带比较弱的问题。放大量扩增；调整扩增温度；调整PCR体系；（不推荐二次PCR）。3、检查酶切位点后面的保护碱基是否数量足够，或者是否合适?查一下PCR实验指南上面好像有一个大表，对每一个酶都有说明。4、感受态是否质量足够好？做一下检测，参照坛子里面相关内容。

[ Last edited by ququr008 on 2010-6-22 at 12:43 ]
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4楼2010-06-22 12:41:56
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xieweitian

铜虫 (小有名气)
★
hutingting(金币+3):谢谢参与
我也是来学习来的。
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520-1314
5楼2010-06-22 13:54:58
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hutingting

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by ququr008 at 2010-06-22 12:41:56:
你需要解决如下几个问题：1、带是否确信是你需要的条带？巢式PCR可以确认。2、带比较弱的问题。放大量扩增；调整扩增温度；调整PCR体系；（不推荐二次PCR）。3、检查酶切位点后面的保护碱基是否数量足够，或者是否 ...

谢谢啦
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6楼2010-06-22 14:09:08
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hutingting

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lly198784 at 2010-06-22 11:22:08:
应该不是引物的问题，因为你PCR出来了，看看是不是PCR体系的问题！

谢谢啊
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7楼2010-06-22 14:09:52
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hutingting

银虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by lly198784 at 2010-06-22 11:22:08:
应该不是引物的问题，因为你PCR出来了，看看是不是PCR体系的问题！

谢谢啦
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8楼2010-06-22 14:10:16
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
★
hutingting(金币+3):谢谢参与
模板是什么？？
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9楼2010-06-22 18:52:30
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ljsh

铁杆木虫 (著名写手)
★
hutingting(金币+3):谢谢参与
引物酶切位点最好靠近5‘端，要加保护碱基
PCR之后，如果琼脂糖凝胶电泳的条带很弱，完全没别要再酶切，连接，感受态细胞的转化。
建议重新设计引物！
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10楼2010-06-22 21:10:21
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