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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】定点突变酶切之后出问题，请教高手~~~~！！！
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maggiell

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】定点突变酶切之后出问题，请教高手~~~~！！！

我刚开始做定点突变，在PCR扩增之后出来的电泳条带是正确的，4000多bp，但是用 DpnI酶切之后的到得电泳条带就出问题了，居然跑到1000bp多去了。问了师姐，他说的得到的条带应该跟原来的差不多才对，我重复做了两三次，得到的结果都是一样的。其中有一次还做了个对照组，很奇怪，在酶切之后对照组中的模板条练居然也还能跑出来（按理说，对照组应该不出线条带才对呀。），结果跟上面说的差不多，，都是在1000多。我实在不明白啊，请前辈们帮我解解疑惑吧！！！
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1楼2011-04-07 09:56:09
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

amilie030312

金虫 (正式写手)
★
maggiell(金币+4):谢谢参与
maggiell(金币+1): 2011-04-07 11:49:45
DpnI用的哪个公司的啊，扔了换个好点公司的酶吧，估计是被酶里面的污染给切碎了吧。
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3楼2011-04-07 11:18:12
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普通回帖

tangbohejin

木虫之王 (文学泰斗)
★
maggiell(金币+4):谢谢参与
maggiell(金币+1): 谢谢 2011-04-07 10:21:01
系统误差考虑考虑。。
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2楼2011-04-07 10:07:40
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西瓜

荣誉版主 (知名作家)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
1949stone(金币+2): 鼓励 2011-04-07 14:01:47
可能你的PCR产物里含有其他Dpn I酶切位点。不如再检查一遍序列的酶切位点？
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4楼2011-04-07 12:41:33
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maggiell

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by amilie030312 at 2011-04-07 11:18:12:
DpnI用的哪个公司的啊，扔了换个好点公司的酶吧，估计是被酶里面的污染给切碎了吧。

我用的是TOYOBO的试剂盒。我们师姐以前用的时候都没事的，不知道我用的时候怎么会这样。
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5楼2011-04-07 14:33:29
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郝钊

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
如果模板也能切出同样的片段，就说明你的模板上本身就含有DpnI这个酶切位点，而且不止一个，有序列的话分析一下酶切位点吧。
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6楼2011-04-07 18:29:55
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zboter

银虫 (正式写手)
分析一下酶切位点吧
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7楼2011-04-07 22:34:19
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
Originally posted by maggiell at 2011-04-07 14:33:29:
我用的是TOYOBO的试剂盒。我们师姐以前用的时候都没事的，不知道我用的时候怎么会这样。

如果片段上酶切位点没有其他的，片段没问题那就证明了小日本的东西该扔了。
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8楼2011-04-18 15:54:46
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yj-lzx

荣誉版主 (文坛精英)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
那就是你的产物里不止一个这样的酶切位点吧~~~
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9楼2011-04-18 16:06:00
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): 这个建议是对的 2011-04-20 08:29:03
片段序列里含有2-3个DpnI的酶切位点，把你的电泳图发上来看一下行吗
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10楼2011-04-18 16:59:32
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夏菡小屋

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): 可以引用回复，这样会给虫友一个提示，方便他看到及时回复你。 2011-04-20 08:29:48
我最近也在做定点突变，但是pcr出来后都没有预期的条带，大概都是1500到2000左右，请问你用的是什么pcr
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11楼2011-04-19 22:32:56
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maggiell

新虫 (初入文坛)
嗯,谢谢大家了.
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12楼2011-04-21 20:43:25
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maggiell

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 空谷幽风 at 2011-04-18 16:59:32:
片段序列里含有2-3个DpnI的酶切位点，把你的电泳图发上来看一下行吗

我实在没办法了,就去问了老师,可能是他设计的引物有点问题,因为酶切后对照组的片段也都没有切完,模版量我稀释得很少了. 电泳图在实验室的电脑里,还没去刻录出来,没办法传上来.
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13楼2011-04-21 20:47:14
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maggiell

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 夏菡小屋 at 2011-04-19 22:32:56:
我最近也在做定点突变，但是pcr出来后都没有预期的条带，大概都是1500到2000左右，请问你用的是什么pcr

inverse  pcr
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14楼2011-04-21 21:05:33
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