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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请教NEB的pmeI的酶切体系已有4人参与

同上,请教NEB的pmeI的酶切体系,最近在做一个克隆,用pmeI和EcoRI酶切,这两个酶没有共同的buffer,只能单个切,中间用纯化的方法和乙醇沉淀的方法都试过了,但是一直没挑到正确的转化子,只有一些空载质粒,大家能不能给些建议啊,谢谢!
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
用共同的buffer啊,buffer 4 啊。
Thank-you,so-blue.
2楼2010-06-02 08:55:10
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)

我用的是不同公司的pmeI和EcoRI酶
3楼2010-06-02 16:39:32
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liyong1981

金虫 (正式写手)



小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
各个公司的酶差别不大,你可以用两种不同的酶,用BUFFER4,怕什么!@!!
4楼2010-06-02 16:45:45
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ben1147

木虫 (正式写手)

★ ★ ★
lstt09nk(金币+3):感谢交流~~ 2010-06-02 17:23:14
第一个酶单酶切之后,和第二个酶切之后都要跑电泳看看切开没有
如果最后转化结果里面只有空载体,可能是酶切不完全
酶切产物最好跑电泳切胶回收,避免没切开的质粒进入连接体系

另外就是要再看看连接体系是不是有问题
5楼2010-06-02 16:48:10
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)

嗯,我拿这两个酶一起双酶切看看,但是请教一下如果单酶切的话,一个一个割胶回收效率会比较低,而且两个酶切位点相距比较近,胶上也看不出来是否切开吧
6楼2010-06-02 17:38:22
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ben1147

木虫 (正式写手)

★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):欢迎交流~~ 2010-06-02 18:38:18
引用回帖:
Originally posted by 维纳斯的骑士 at 2010-06-02 17:38:22:
嗯,我拿这两个酶一起双酶切看看,但是请教一下如果单酶切的话,一个一个割胶回收效率会比较低,而且两个酶切位点相距比较近,胶上也看不出来是否切开吧

回收效率问题倒不是很大,初始样品多加一点(质粒比较好办,PCR产物的话牵扯到PCR效率和产物回收的问题,可能样品量受限制,最好能连T载体转化提质粒之后再切),最后回收完跑电泳只要能看见就行

酶切位点距离的话要看有多近了,相差几十bp的话,控制一下电泳条件还有希望看见,100bp以上基本没什么问题。如果是相邻的位点,相差几bp的话,同步双酶切可能切不开,离得不能太近。这种情况还是推荐分步酶切
7楼2010-06-02 18:00:00
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)

嗯,受益非浅,有问题再请教你啊
8楼2010-06-02 18:07:22
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