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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】请教NEB的pmeI的酶切体系
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】请教NEB的pmeI的酶切体系 已有4人参与

同上，请教NEB的pmeI的酶切体系，最近在做一个克隆，用pmeI和EcoRI酶切，这两个酶没有共同的buffer，只能单个切，中间用纯化的方法和乙醇沉淀的方法都试过了，但是一直没挑到正确的转化子，只有一些空载质粒，大家能不能给些建议啊，谢谢！
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1楼 2010-06-02 07:21:52
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
用共同的buffer啊，buffer 4 啊。
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Thank-you，so-blue.
2楼2010-06-02 08:55:10
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)
我用的是不同公司的pmeI和EcoRI酶
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3楼2010-06-02 16:39:32
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
各个公司的酶差别不大，你可以用两种不同的酶，用BUFFER4，怕什么！@！！
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4楼2010-06-02 16:45:45
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★
lstt09nk(金币+3):感谢交流~~ 2010-06-02 17:23:14
第一个酶单酶切之后，和第二个酶切之后都要跑电泳看看切开没有
如果最后转化结果里面只有空载体，可能是酶切不完全
酶切产物最好跑电泳切胶回收，避免没切开的质粒进入连接体系

另外就是要再看看连接体系是不是有问题
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5楼2010-06-02 16:48:10
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)
嗯，我拿这两个酶一起双酶切看看，但是请教一下如果单酶切的话，一个一个割胶回收效率会比较低，而且两个酶切位点相距比较近，胶上也看不出来是否切开吧
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6楼2010-06-02 17:38:22
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ben1147

木虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):欢迎交流~~ 2010-06-02 18:38:18
引用回帖:
Originally posted by 维纳斯的骑士 at 2010-06-02 17:38:22:
嗯，我拿这两个酶一起双酶切看看，但是请教一下如果单酶切的话，一个一个割胶回收效率会比较低，而且两个酶切位点相距比较近，胶上也看不出来是否切开吧

回收效率问题倒不是很大，初始样品多加一点（质粒比较好办，PCR产物的话牵扯到PCR效率和产物回收的问题，可能样品量受限制，最好能连T载体转化提质粒之后再切），最后回收完跑电泳只要能看见就行

酶切位点距离的话要看有多近了，相差几十bp的话，控制一下电泳条件还有希望看见，100bp以上基本没什么问题。如果是相邻的位点，相差几bp的话，同步双酶切可能切不开，离得不能太近。这种情况还是推荐分步酶切
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7楼2010-06-02 18:00:00
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维纳斯的骑士

金虫 (小有名气)
嗯，受益非浅，有问题再请教你啊
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8楼2010-06-02 18:07:22
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