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xuqingchun33银虫 (小有名气)
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[求助]
双酶切体系是什么意思
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各位大侠，请问一下下面的这个双酶切体系是什么意思？能否举个例子，谢谢 Double Digestion with BamHI, NdeI We recommend: Buffer 2X Tango? 2-fold excess of BamHI 2-fold excess of NdeI Incubate at 37°C |
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 【分子生物】EPI帖 |
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2楼2011-07-02 15:26:07
shuifen1108
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3楼2011-07-02 15:38:19
lxj341401
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【答案】应助回帖
★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, EPI+1): Good!讲得很清楚了！ 2011-07-02 16:48:36
xuqingchun33(金币+1): 2011-07-03 12:49:56
西瓜(金币+5, EPI+1): Good!讲得很清楚了！ 2011-07-02 16:48:36
xuqingchun33(金币+1): 2011-07-03 12:49:56
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一看就知道楼主用的是fermentas公司的限制性内切酶。 Double Digestion with BamHI, NdeI就是选择的酶是BamHI, NdeI。 We recommend: Buffer 2X Tango该公司推荐使用的酶切缓冲液是2X Tango，就是加酶切体系总体积的1/5的10X Tango。 2-fold excess of BamHI 2-fold excess of NdeI因为这两个酶在2X Tango条件下活性都只有50-100%，不是100%，为了保证切割效率，所以加入的酶量是2倍。 Incubate at 37°C 这个就是酶切温度了。 |
4楼2011-07-02 16:09:34
青菜小虫
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5楼2011-07-02 17:17:28
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【答案】应助回帖
★ ★ ★
西瓜(金币+3, EPI+1): 很有经验啊！酶的用量是可以省一些，大不了切久点就好了。很多酶在1X和2X tango中活性差别很大，可根据Fermentas那个表，用1X时就加总体积1/10的10X tango，用2X时就加1/5. 2011-07-02 21:02:51
xuqingchun33(金币+1): 2011-07-03 12:50:07
西瓜(金币+3, EPI+1): 很有经验啊！酶的用量是可以省一些，大不了切久点就好了。很多酶在1X和2X tango中活性差别很大，可根据Fermentas那个表，用1X时就加总体积1/10的10X tango，用2X时就加1/5. 2011-07-02 21:02:51
xuqingchun33(金币+1): 2011-07-03 12:50:07
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放培养箱和水浴锅没有什么影响，只要保证在这个温度下酶的效率是最大发挥的就没有什么问题，有时候室内温度高，可以达到30几度，照样室温进行酶切； 另外buffer 2x tango,就是1/5的比例，就是总体积的五分之一，50ul体系的话添加10ul ，一般如果没有特殊说明的话就是1/10,加5ul； 至于酶，也就是按照原体系量的二倍来加，因为两种酶的活性在此条件和buffer下不是很高，很有可能是50%，比如50ul体系，加2ul，现在加4ul，其实个人认为具体实验中加2ul就可以了，不需要加那么多酶，浪费。。。 |
8楼2011-07-02 20:52:28
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