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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 转质粒不成功,好几次了,大家给分析一下问题会出在哪里
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造血干细胞

铜虫 (初入文坛)

[求助] 转质粒不成功,好几次了,大家给分析一下问题会出在哪里

目前在做质粒构建,问题是,载体酶切,片段酶切之后连接转化涂板总是什么都不长,试过电转,DH4a转,都没有成功,我之前没怎么做过,实在不清楚问题出在哪里,求高手指教
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1楼2011-08-23 17:03:33
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aayqaa

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 是需要考虑，鼓励交流 2011-08-23 19:11:44
原因可能有很多，感受态细胞是否不行？连接是否成功？
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2楼2011-08-23 18:03:04
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叶心飞翔

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 是要认真的 2011-08-23 19:11:55
质粒有没有特殊性，有没有做阳性对照？还是仔细的做好每步工作
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3楼2011-08-23 18:06:27
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blackrose8089

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

实在不行的话，楼主能不能考虑让师兄姐妹代做一下看看！
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jiayoubashaonian
4楼2011-08-23 20:42:49
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
造血干细胞(金币+1): 片段是pcr扩出来的,当时特异性都不错,是双酶切不错,根据你说的我估计是酶切没切好 2011-08-23 21:35:09
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2011-08-23 23:34:18
先转个完整的载体质粒看看长不长，不长的话就是感受态或者操作的问题，如果长就要从酶切方面考虑，载体和片段是不是都完全酶切了：
（1）载体如果是双酶切，建议你先用两种酶分别单切，看看是否都能切开
（2）片段如果是从质粒上切下来的，那应该问题不大；如果是酶切的PCR产物，请确认保护碱基的数量是否足够，一般每个位点有5个保护碱基比较保险
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
5楼2011-08-23 21:05:32
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 专家就是专家 2011-08-23 23:06:38
很明显主要原因应该是连接的问题了
1：你的载体和基因酶切是否完全，尤其是载体，酶切出来的条带要单一；还有就是载体和基因酶切完全后，要纯化完全，不然很影响后期连接酶的效率的；
2：连接体系的设置，可以根据你载体和目的片段的大小，以及纯化跑电泳出来的浓度进行定量，然后确定连接体系中载体添加多少，基因添加多少，这一步其实也很关键，如果体系中各反应物不合适，那做一个克隆就比较难成功；
3：转化，感受态细胞效率如何？筛选标记中如何（比如抗生素，抗生素抗性，浓度等等）
4：一般24h之内只要长出来应该问题不大，如果超过24h了基本就over了
一步一步检查一下，看看哪一步问题比较大。。。然后再寻找解决对策！
祝你好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
6楼2011-08-23 21:44:05
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造血干细胞

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-23 21:44:05:
很明显主要原因应该是连接的问题了
1：你的载体和基因酶切是否完全，尤其是载体，酶切出来的条带要单一；还有就是载体和基因酶切完全后，要纯化完全，不然很影响后期连接酶的效率的；
2：连接体系的设置，可以根 ...

1.酶切过纯化后我都是跑电泳看过条带的,
2.我还是觉得是我的链接体系有问题,那么请问通用比例是多少呢
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7楼2011-08-24 10:06:46
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-24 10:55:04
引用回帖:
7楼: Originally posted by 造血干细胞 at 2011-08-24 10:06:46:
1.酶切过纯化后我都是跑电泳看过条带的,
2.我还是觉得是我的链接体系有问题,那么请问通用比例是多少呢

没有所谓的通用比例，具体载体和基因添加多少，我们这边有个公式:1/10<载体质量/大小/基因质量/基因大小<1/3

所以连接体系中载体和基因的添加量不光是根据纯化电泳后的亮度而定，还要根据载体和基因的大小而定。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
8楼2011-08-24 10:29:55
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造血干细胞

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 天使托 at 2011-08-24 10:29:55:
没有所谓的通用比例，具体载体和基因添加多少，我们这边有个公式:1/10<载体质量/大小/基因质量/基因大小<1/3

所以连接体系中载体和基因的添加量不光是根据纯化电泳后的亮度而定，还要根据载体和基因的大 ...

一般3～5kb的质粒载体于20微升的连接体系中加0.05-0.1微克，目的基因与载体的摩尔数之比1约3：1（双酶切的情况下）。这种说法对吗
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9楼2011-08-24 11:03:44
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
引用回帖:
9楼: Originally posted by 造血干细胞 at 2011-08-24 11:03:44:
一般3～5kb的质粒载体于20微升的连接体系中加0.05-0.1微克，目的基因与载体的摩尔数之比1约3：1（双酶切的情况下）。这种说法对吗

不完全对。。。说的不太准确。。。
你就按我给你说的公式 算算，出来肯定有一个添加量的范围。。。
要不你说说你定量出来的载体和基因是多少？1ul载体和基因分别多少ng？
载体多大？基因多大？
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10楼2011-08-24 11:14:30
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