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造血干细胞铜虫 (初入文坛)
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[求助]
转质粒不成功,好几次了,大家给分析一下问题会出在哪里
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| 目前在做质粒构建,问题是,载体酶切,片段酶切之后连接转化涂板总是什么都不长,试过电转,DH4a转,都没有成功,我之前没怎么做过,实在不清楚问题出在哪里,求高手指教 |
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 【分子生物】EPI帖 |
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blackrose8089
铁杆木虫 (职业作家)
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【答案】应助回帖
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造血干细胞(金币+1): 片段是pcr扩出来的,当时特异性都不错,是双酶切不错,根据你说的我估计是酶切没切好 2011-08-23 21:35:09
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2011-08-23 23:34:18
造血干细胞(金币+1): 片段是pcr扩出来的,当时特异性都不错,是双酶切不错,根据你说的我估计是酶切没切好 2011-08-23 21:35:09
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2011-08-23 23:34:18
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先转个完整的载体质粒看看长不长，不长的话就是感受态或者操作的问题，如果长就要从酶切方面考虑，载体和片段是不是都完全酶切了： （1）载体如果是双酶切，建议你先用两种酶分别单切，看看是否都能切开 （2）片段如果是从质粒上切下来的，那应该问题不大；如果是酶切的PCR产物，请确认保护碱基的数量是否足够，一般每个位点有5个保护碱基比较保险 |
5楼2011-08-23 21:05:32
