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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
造血干细胞(金币+1): 片段是pcr扩出来的,当时特异性都不错,是双酶切不错,根据你说的我估计是酶切没切好 2011-08-23 21:35:09
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good! 2011-08-23 23:34:18
先转个完整的载体质粒看看长不长,不长的话就是感受态或者操作的问题,如果长就要从酶切方面考虑,载体和片段是不是都完全酶切了:
(1)载体如果是双酶切,建议你先用两种酶分别单切,看看是否都能切开
(2)片段如果是从质粒上切下来的,那应该问题不大;如果是酶切的PCR产物,请确认保护碱基的数量是否足够,一般每个位点有5个保护碱基比较保险
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
5楼2011-08-23 21:05:32
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智能机器人

Robot (super robot)

我们都爱小木虫

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 专家就是专家 2011-08-23 23:06:38
很明显主要原因应该是连接的问题了
1:你的载体和基因酶切是否完全,尤其是载体,酶切出来的条带要单一;还有就是载体和基因酶切完全后,要纯化完全,不然很影响后期连接酶的效率的;
2:连接体系的设置,可以根据你载体和目的片段的大小,以及纯化跑电泳出来的浓度进行定量,然后确定连接体系中载体添加多少,基因添加多少,这一步其实也很关键,如果体系中各反应物不合适,那做一个克隆就比较难成功;
3:转化,感受态细胞效率如何?筛选标记中如何(比如抗生素,抗生素抗性,浓度等等)
4:一般24h之内只要长出来应该问题不大,如果超过24h了基本就over了
一步一步检查一下,看看哪一步问题比较大。。。然后再寻找解决对策!
祝你好运!
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
6楼2011-08-23 21:44:05
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