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空谷幽风

金虫 (正式写手)

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
造血干细胞(金币+1): 片段是pcr扩出来的,当时特异性都不错,是双酶切不错,根据你说的我估计是酶切没切好 2011-08-23 21:35:09
西瓜(金币+5, MolEPI+1): Good！ 2011-08-23 23:34:18

先转个完整的载体质粒看看长不长，不长的话就是感受态或者操作的问题，如果长就要从酶切方面考虑，载体和片段是不是都完全酶切了：
（1）载体如果是双酶切，建议你先用两种酶分别单切，看看是否都能切开
（2）片段如果是从质粒上切下来的，那应该问题不大；如果是酶切的PCR产物，请确认保护碱基的数量是否足够，一般每个位点有5个保护碱基比较保险

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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?

5楼2011-08-23 21:05:32

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 专家就是专家 2011-08-23 23:06:38

很明显主要原因应该是连接的问题了
1：你的载体和基因酶切是否完全，尤其是载体，酶切出来的条带要单一；还有就是载体和基因酶切完全后，要纯化完全，不然很影响后期连接酶的效率的；
2：连接体系的设置，可以根据你载体和目的片段的大小，以及纯化跑电泳出来的浓度进行定量，然后确定连接体系中载体添加多少，基因添加多少，这一步其实也很关键，如果体系中各反应物不合适，那做一个克隆就比较难成功；
3：转化，感受态细胞效率如何？筛选标记中如何（比如抗生素，抗生素抗性，浓度等等）
4：一般24h之内只要长出来应该问题不大，如果超过24h了基本就over了
一步一步检查一下，看看哪一步问题比较大。。。然后再寻找解决对策！
祝你好运！

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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!

6楼2011-08-23 21:44:05

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