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造血干细胞

铜虫 (初入文坛)

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专业: 免疫学研究新技术与新方法

[求助] 转质粒不成功,好几次了,大家给分析一下问题会出在哪里

目前在做质粒构建,问题是,载体酶切,片段酶切之后连接转化涂板总是什么都不长,试过电转,DH4a转,都没有成功,我之前没怎么做过,实在不清楚问题出在哪里,求高手指教

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1楼 2011-08-23 17:03:33

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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

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管辖: 微生物

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
西瓜(金币+5, MolEPI+1): 专家就是专家 2011-08-23 23:06:38

很明显主要原因应该是连接的问题了
1：你的载体和基因酶切是否完全，尤其是载体，酶切出来的条带要单一；还有就是载体和基因酶切完全后，要纯化完全，不然很影响后期连接酶的效率的；
2：连接体系的设置，可以根据你载体和目的片段的大小，以及纯化跑电泳出来的浓度进行定量，然后确定连接体系中载体添加多少，基因添加多少，这一步其实也很关键，如果体系中各反应物不合适，那做一个克隆就比较难成功；
3：转化，感受态细胞效率如何？筛选标记中如何（比如抗生素，抗生素抗性，浓度等等）
4：一般24h之内只要长出来应该问题不大，如果超过24h了基本就over了
一步一步检查一下，看看哪一步问题比较大。。。然后再寻找解决对策！
祝你好运！