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rollandyoung

金虫 (小有名气)

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专业: 食用真菌学

[求助] 质粒DNA提取成了这样，请大家帮忙分析一下

一、试验内容：
1. 质粒pCAMBIA1301DNA提取
2. 对提取的质粒DNA根据质粒图谱上的酶切位点进行验证性的酶切，所用酶Xho1。
3. 根据一篇已发表的论文所用的引物序列设计引物，进行验证性的PCR扩增。
二、主要试验材料：含有质粒的大肠杆菌（已经液体LB培养基摇菌16小时）
三、方法：参照分子克隆实验指南第三版方案一 SDS碱裂解法制备质粒DNA：小量制备
四、结果：1.质粒DNA见电泳照片
2.酶切产物经电泳显示无酶切产物出现
3. PCR扩增无扩增产物出现
问题：
综合上述结果，使我对我提取的质粒DNA的质量产生了疑问，总结了以下问题
1. 我知道正常的质粒DNA电泳应该能够呈现出很亮且较宽的带型，这种情况属于正常吗？大家是否以前也遇到过这样的问题，是怎样解决的？
2. 质粒DNA提取过程中有哪些需要注意的地方？
3. 提取质粒DNA用到的试剂有特殊的要求和需要注意的地方吗？
4. 除上述问题外还有哪些需要注意和改进的地方？

已经被这个问题困扰了整个假期了，严重地影响了下一步的试验进程，故求助的心情十分之迫切，希望大家不吝赐教，在此先行谢过！

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1楼 2011-08-29 10:45:40

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keyasyie

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引用回帖:

17楼: Originally posted by rollandyoung at 2011-09-02 12:32:40:
1. 之前按照说明书的反应体系我做过，电泳显示无酶切片段。
2. buffer是按照说明书的要求加的，质粒DNA的量确实是多了一些，原因是我提的质粒DNA就不亮，所以我把质粒的反应量提高了。
3. 继续求助，呵呵！

不知道你用的什么公司的酶
一般来说10X的BUFFER 20ul体系加2ul足够了
质粒DNA浓度低可以多提取几次然后混在一起在浓缩纯化一下
分子克隆上的方法很经典老板没钱就不用买试剂盒了
个人观点仅供参考希望对你有帮助