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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 请大家帮我分析下我提的质粒怎么这么多条带呀?
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lijia2054224

金虫 (初入文坛)

[求助] 请大家帮我分析下我提的质粒怎么这么多条带呀?

我提的质粒怎么有4条带啊？我想要的是最上面那条弱弱的带，请问质粒是不是不纯呀？是不是有两种质粒存在呀？
请大家帮我分析下我提的质粒怎么这么多条带呀?
ce1,2,4 9-23.jpg
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1楼 2013-09-23 17:35:32
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回帖置顶 ( 共有1个 )

shyh1983

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
lijia2054224: 金币+3, ★有帮助 2013-09-24 21:39:13
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-25 08:44:12
gyesang: 回帖置顶 2013-09-28 02:16:28
对于新提的质粒来说，琼脂糖电泳检测的目的是看看有没有提出来，以及所提质粒的质量如何而不是看其大小，由于所提质粒的状态问题如超螺旋质粒、开环质粒和质粒复制中间体，一般会出现3条带，如果质粒提的好会仅出现一条带（为超螺旋，迁移速率最快），但由于每个人实验操作的技术不一样有时也会出现5条带。因此，质粒的实际大小不能用琼脂糖电泳来衡量，而是要通过单酶切线性化或双酶切然后电泳来分析你的质粒是否为你想要的重组质粒。无论你提的质粒跑出来是3条抑或5条带，可能都是你要的东西只是质粒的状态不同罢了，最简单的鉴定方法就是刚才提到的单酶切（可以确认质粒的实际大小，如载体序列5300bp，目的基因1000bp，那么线性化后电泳，其条带位置就在6300bp左右）或双酶切（如载体序列5300bp，目的基因1000bp，那么双酶切后电泳，其条带位置就在5300bp和1000bp各有一条带）。
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10楼2013-09-24 11:12:57
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小黑L小白

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-25 08:43:57
1 电泳质粒要用超螺旋MAKER。用普通的MARKER是没有参考价值的。
2 不同的试剂盒提出的质粒质量不一样，而且质粒有三条带很正常，分别是线状，环转，和超螺旋三种结构。
3 一般比较严谨的看质粒是进行单酶切，看大小。
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4楼2013-09-23 19:53:08
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desheng101

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+1, 鼓励发帖交流！ 2013-09-23 18:24:55
楼主第二条带是MAKER吗？
质粒正常状态就是3条带。
楼主是不是大提的？
还有为啥你的点样空那么亮？
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2楼2013-09-23 18:03:09
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lijia2054224

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by desheng101 at 2013-09-23 18:03:09
楼主第二条带是MAKER吗？
质粒正常状态就是3条带。
楼主是不是大提的？
还有为啥你的点样空那么亮？

你好，谢谢你。
第一泳道是marker，但是我的marker有点小。
我就是用tiangen提质粒试剂盒提的质粒。
我要的是最上边那条很弱的带。
至于点样孔亮，我也不太清楚。
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3楼2013-09-23 18:42:07
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desheng101

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lijia2054224: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-09-24 21:41:34
kx444555: 金币+3, 鼓励交流 2013-09-25 08:44:06
给楼主点经验；不一定是你的原因，但是提质粒必须要注意的几点；
1；你提取过程中重悬，裂解，中和这三步极为重要，裂解只要变清就可以直接加中和液。
2；质粒做个单酶切。
3；点样孔的事情问问你们实验室的同学，嘿嘿
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5楼2013-09-23 21:22:00
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淘淘279

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
弱弱的问一下，检测的条带最上边的一条，大小都没对应marker，确定它就是你想要的？

[ 发自小木虫客户端 ]
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你能做的永远不止这些！
6楼2013-09-23 21:58:05
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lijia2054224

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by desheng101 at 2013-09-23 21:22:00
给楼主点经验；不一定是你的原因，但是提质粒必须要注意的几点；
1；你提取过程中重悬，裂解，中和这三步极为重要，裂解只要变清就可以直接加中和液。
2；质粒做个单酶切。
3；点样孔的事情问问你们实验室的同学 ...

谢谢你，我做个单酶切试试吧，嘿嘿
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7楼2013-09-24 09:42:15
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lijia2054224

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 小黑L小白 at 2013-09-23 19:53:08
1 电泳质粒要用超螺旋MAKER。用普通的MARKER是没有参考价值的。
2 不同的试剂盒提出的质粒质量不一样，而且质粒有三条带很正常，分别是线状，环转，和超螺旋三种结构。
3 一般比较严谨的看质粒是进行单酶切，看大 ...

多谢多谢，做单酶切我还真是没想到，嘿嘿
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8楼2013-09-24 09:43:06
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lijia2054224

金虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 淘淘279 at 2013-09-23 21:58:05
弱弱的问一下，检测的条带最上边的一条，大小都没对应marker，确定它就是你想要的？

嘿嘿，我之前拿空载和这个重组质粒一块跑过，虽然marker还是没有对应上，但应该是那条带的。而且我的载体是单拷贝的，提到的量是很少的。就是这样。
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9楼2013-09-24 09:45:43
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