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zhang8826857铁杆木虫 (著名写手)
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[求助]
求解释这pcr是啥问题，帮同学问的^_^
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这是以质粒为模板，扩增质粒上的EGFP基因，结果没扩出来，是不是模板的量加的太大呀？跑出来的条带是模板吧？我提质粒之后，50ul的pcr体系加了模板0.5微升，没做出来，然后我把提的质粒稀释了10倍，加0.5ul又没做出来，连条带都没有，大家帮着分析下士啥问题呀？（最右边是天根Marker3，200bp，500，800，1200，2000，3000，4500bp，目的片段应该是700左右，从右边数第二三个不是，是帮别人跑了两个样，其余的是pcr的结果） [ Last edited by zhang8826857 on 2012-4-5 at 09:37 ] |
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 PCR技术 | 基因工程、分子技术、微生物理论 | 【分子生物】EPI帖 |
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8楼2012-04-05 11:19:54
zhaohq1209
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【答案】应助回帖
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质粒提取之后不酶切直接跑电泳的方法没法确定质粒的大小和纯度，但从图上来看质粒提取还是比较成功的，用来做模板应该没有问题。 做PCR的时候要加入阳性对照，这样就能确定你的PCR体系和条件是不是有问题。就是确保在你的体系和条件下一定能扩增出来条带，比如在你的问题中，如果加入了阳性对照且能扩增出来条带，说明你的PCR本身是没有问题的。 建议： 1、用nanodrop测一下质粒的浓度，每个PCR反应加入的模板量应该为10~100ng； 2、重复PCR实验。可采用不同的聚合酶进行扩增，最好能做退火温度的梯度； 3、如果手头有针对质粒的其他引物，可以同步扩增，这样可以直接确定模板是不是有问题。 如上三步，基本上就能找出问题所在。祝顺利~好运~ |
10楼2012-04-05 12:20:16
2楼2012-04-05 09:44:35
3楼2012-04-05 09:52:49
xinshen0915
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【答案】应助回帖
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小丹木木: 金币+3, 应助指数+1, 很认同，考虑梯度很有道理的啊 2012-04-05 11:39:18
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zhang8826857: 金币+5, ★有帮助 2012-04-05 15:51:34
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下面的条带应该是引物二聚体，上面的条带很有可能是质粒模板，在做PCR之前要先检测质粒的浓度，一般以质粒为模板做PCR扩增是应该先稀释模板的。问题可以考虑从几个方面解决： 1、确保你的反应体系没有问题，看是否有某种成分未加，确保DNA聚合酶,dNTP, ddH2O等都没有问题； 2、换一种DNA聚合酶试一下； 3、看是否是退火温度设置不合理，可以考虑梯度扩增； 4、如果换了聚合酶和退火温度还是扩不出来，就得考虑是不是引物设计不合理了。 |
4楼2012-04-05 10:01:55
5楼2012-04-05 10:22:21
zhaohq1209
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6楼2012-04-05 11:00:44
天使托
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7楼2012-04-05 11:03:18
9楼2012-04-05 11:23:03
