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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求解释这pcr是啥问题，帮同学问的^_^
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zhang8826857

铁杆木虫 (著名写手)

[求助] 求解释这pcr是啥问题，帮同学问的^_^

这是以质粒为模板，扩增质粒上的EGFP基因，结果没扩出来，是不是模板的量加的太大呀？跑出来的条带是模板吧？我提质粒之后，50ul的pcr体系加了模板0.5微升，没做出来，然后我把提的质粒稀释了10倍，加0.5ul又没做出来，连条带都没有，大家帮着分析下士啥问题呀？（最右边是天根Marker3，200bp，500，800，1200，2000，3000，4500bp，目的片段应该是700左右，从右边数第二三个不是，是帮别人跑了两个样，其余的是pcr的结果）


[ Last edited by zhang8826857 on 2012-4-5 at 09:37 ]
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好孩子！
1楼 2012-04-05 09:32:08
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回帖置顶 ( 共有2个 )

张文妮

新虫 (小有名气)
西瓜: 回帖置顶 2012-04-05 18:51:09
引用回帖:
6楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-04-05 11:00:44:
用细菌直接作为模板扩增试试；

另：PCR怎么能不加对照呢？

我没做过菌落pcr,但是质粒我是刚提的，跑电泳出来是有的，质粒电泳图片如下，Marker是λ- Hind III DNA Marker。。。紧接着就做pcr了，就是一楼的图片。另外，PCR怎么加对照？我没做过，请指教~~
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8楼2012-04-05 11:19:54
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小丹木木: 金币+3, 很有用哦 2012-04-05 13:51:04
zhang8826857: 金币+10, ★有帮助 2012-04-05 15:52:11
西瓜: 金币+2, MolEPI+1, Good! 2012-04-05 17:14:51
引用回帖:
8楼: Originally posted by 张文妮 at 2012-04-05 11:19:54:
我没做过菌落pcr,但是质粒我是刚提的，跑电泳出来是有的，质粒电泳图片如下，Marker是λ- Hind III DNA Marker。。。紧接着就做pcr了，就是一楼的图片。另外，PCR怎么加对照？我没做过，请指教~~
62/48/876432_1 ...

质粒提取之后不酶切直接跑电泳的方法没法确定质粒的大小和纯度，但从图上来看质粒提取还是比较成功的，用来做模板应该没有问题。

做PCR的时候要加入阳性对照，这样就能确定你的PCR体系和条件是不是有问题。就是确保在你的体系和条件下一定能扩增出来条带，比如在你的问题中，如果加入了阳性对照且能扩增出来条带，说明你的PCR本身是没有问题的。

建议：

1、用nanodrop测一下质粒的浓度，每个PCR反应加入的模板量应该为10~100ng；

2、重复PCR实验。可采用不同的聚合酶进行扩增，最好能做退火温度的梯度；

3、如果手头有针对质粒的其他引物，可以同步扩增，这样可以直接确定模板是不是有问题。

如上三步，基本上就能找出问题所在。祝顺利~好运~
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
10楼2012-04-05 12:20:16
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普通回帖

telomerase

至尊木虫 (著名写手)

cain
★
西瓜: 金币+1, 确实疑问多多 2012-04-05 18:50:39
你跑个质粒看看位置不就知道，是不是了
你质粒4000多？
引物验证过没问题？酶啥的也没事？
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我的路靠我的脚踩出来！！！不走寻常路！！！
2楼2012-04-05 09:44:35
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张文妮

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by telomerase at 2012-04-05 09:44:35:
你跑个质粒看看位置不就知道，是不是了
你质粒4000多？
引物验证过没问题？酶啥的也没事？

你好~我就是他的同学，质粒确实是4000多，引物也没有问题，酶是刚买的，Takala的，应给不会有问题。我怀疑是不是模板加的量过了。。
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3楼2012-04-05 09:52:49
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xinshen0915

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 应助指数+1, 很认同，考虑梯度很有道理的啊 2012-04-05 11:39:18
zhang8826857: 金币+5, ★有帮助 2012-04-05 15:51:34
下面的条带应该是引物二聚体，上面的条带很有可能是质粒模板，在做PCR之前要先检测质粒的浓度，一般以质粒为模板做PCR扩增是应该先稀释模板的。问题可以考虑从几个方面解决：
1、确保你的反应体系没有问题，看是否有某种成分未加，确保DNA聚合酶,dNTP, ddH2O等都没有问题；
2、换一种DNA聚合酶试一下；
3、看是否是退火温度设置不合理，可以考虑梯度扩增；
4、如果换了聚合酶和退火温度还是扩不出来，就得考虑是不是引物设计不合理了。
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Go home or stand up！It's your fucking choice.Do you still remember the reason why you are here?
4楼2012-04-05 10:01:55
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张文妮

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by xinshen0915 at 2012-04-05 10:01:55:
下面的条带应该是引物二聚体，上面的条带很有可能是质粒模板，在做PCR之前要先检测质粒的浓度，一般以质粒为模板做PCR扩增是应该先稀释模板的。问题可以考虑从几个方面解决：
1、确保你的反应体系没有问题，看是 ...

我第二次做是把模板稀释了10倍的，但是电泳跑出来一点儿条带都没有，不像上面的图还有模板条带和引物二聚体条带。。。这又会是什么问题呢？我确实是梯度扩增，而且退火温度是按引物的Tm设置的。
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5楼2012-04-05 10:22:21
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+5, ★有帮助 2012-04-05 15:51:51
用细菌直接作为模板扩增试试；

另：PCR怎么能不加对照呢？
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
6楼2012-04-05 11:00:44
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 专家考核 2012-04-05 11:40:46
zhang8826857: 金币+5, ★有帮助 2012-04-05 15:51:59
1:你的质粒确定没有问题吧？有没有提出来点样看看，或者有没有污染呢？
2：50ul加入的质粒（模板）浓度不算大。。。
3：引物是否有问题呢？
4：pcr条件，退火温度或者延伸时间是否合适？

祝好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
7楼2012-04-05 11:03:18
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张文妮

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 天使托 at 2012-04-05 11:03:18:
1:你的质粒确定没有问题吧？有没有提出来点样看看，或者有没有污染呢？
2：50ul加入的质粒（模板）浓度不算大。。。
3：引物是否有问题呢？
4：pcr条件，退火温度或者延伸时间是否合适？

祝好运！

谢谢~质粒应该没有问题，刚提的。跑出来的电泳图片在8楼~~
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9楼2012-04-05 11:23:03
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