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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求解释这pcr是啥问题，帮同学问的^_^
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yuluoqiutong

木虫 (正式写手)

初出茅庐

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+5, ★有帮助 2012-04-05 15:52:27
我刚也用的EGFP基因做的，效果还不错。看你的情况，质粒模板已经很多了，其他如果没问题，那就是退火温度没有找对，多试几个温度吧。会出条带的
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11楼2012-04-05 15:42:47
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王雨云

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+5, ★有帮助 2012-04-05 15:52:34
可以直接做菌落PCR看看，再把你提的质粒做个酶切，确保你的目的片断在里面
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12楼2012-04-05 15:45:03
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张文妮

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by zhaohq1209 at 2012-04-05 12:20:16:
质粒提取之后不酶切直接跑电泳的方法没法确定质粒的大小和纯度，但从图上来看质粒提取还是比较成功的，用来做模板应该没有问题。

做PCR的时候要加入阳性对照，这样就能确定你的PCR体系和条件是不是有问题。就 ...

太谢谢你了~那我试试
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13楼2012-04-05 15:55:59
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张文妮

新虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by yuluoqiutong at 2012-04-05 15:42:47:
我刚也用的EGFP基因做的，效果还不错。看你的情况，质粒模板已经很多了，其他如果没问题，那就是退火温度没有找对，多试几个温度吧。会出条带的

好的，谢谢，我再试试，祝你也实验顺利~~
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14楼2012-04-05 15:56:51
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张文妮

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 王雨云 at 2012-04-05 15:45:03:
可以直接做菌落PCR看看，再把你提的质粒做个酶切，确保你的目的片断在里面

哦，这个方法我也考虑考虑，谢谢~~
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15楼2012-04-05 15:57:40
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xinshen0915

新虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★ ★
西瓜: 金币+5 2012-04-05 18:51:41
引用回帖:
5楼: Originally posted by 张文妮 at 2012-04-05 10:22:21:
我第二次做是把模板稀释了10倍的，但是电泳跑出来一点儿条带都没有，不像上面的图还有模板条带和引物二聚体条带。。。这又会是什么问题呢？我确实是梯度扩增，而且退火温度是按引物的Tm设置的。

你做个阳性对照试一下吧，看是不是体系中有问题，找个你确定能扩出来的模板和引物，最好这个对照的目的片段扩出来与你的实验组的目的片段大小和退火温度比较相近，如果此阳性对照能扩出来，而你的实验组仍扩不出来，那就证明你的反应体系没问题，那就有可能是你的引物设计有问题，或者是模板有问题。如果连阳性对照都没扩出来，那就把DNA聚合酶,dNTP, ddH2O换了试一下，做PCR最好作对照，不然结果不好解释，正负对照都要做，负对照就是把所有的成分除了模板都加，看体系是否有污染。实验都难免会遇到问题，不要灰心，祝你好运~
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Go home or stand up！It's your fucking choice.Do you still remember the reason why you are here?
16楼2012-04-05 16:58:45
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麻花13

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+2 2012-04-07 20:38:18
尝试一下用小体系，20ul，有时候体系不同，结果会相差很大
我就有一次做overlap，20ul体系做出来，50ul体系，条带却怎么也跑不动，好像不止一次
此外，建议在做PCR前，做一下酶切鉴定，看看目的条带到底在不在
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17楼2012-04-05 18:49:51
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小白虾

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, ★有帮助 2012-04-07 20:38:29
你好，你确定引物没有问题?引物二聚体特别多，你可以做个退火温度梯度试试。
至于模板的量确实太多啦，再不确定做个阳性对照。体系各物质的量合适吗？
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飞的更高
18楼2012-04-05 20:43:31
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
zhang8826857: 金币+1, ★有帮助 2012-04-07 20:38:35
楼上们的建议都很实际，如果以上问题都排除了，看到电泳图中引物二聚体很浓，可能怀疑两个问题：
1：引物稀释的有问题，浓度不正确，导致扩增失败。
2：引物设计的不好，实在不行就重新设计引物吧。多考虑下两条引物的Tm值差异，GC含量，还有自身的二级结构。
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生活是面镜子~
19楼2012-04-05 22:43:57
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laojiu9878

至尊木虫 (知名作家)

九牛

【答案】应助回帖

★
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zhang8826857: 金币+1, ★有帮助 2012-04-07 20:38:41
模板太多，0.5质粒太多，引物怎么样？？
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但愿人长久
20楼2012-04-06 08:36:39
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