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zhang8826857铁杆木虫 (著名写手)
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[求助]
求解释这pcr是啥问题，帮同学问的^_^
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这是以质粒为模板，扩增质粒上的EGFP基因，结果没扩出来，是不是模板的量加的太大呀？跑出来的条带是模板吧？我提质粒之后，50ul的pcr体系加了模板0.5微升，没做出来，然后我把提的质粒稀释了10倍，加0.5ul又没做出来，连条带都没有，大家帮着分析下士啥问题呀？（最右边是天根Marker3，200bp，500，800，1200，2000，3000，4500bp，目的片段应该是700左右，从右边数第二三个不是，是帮别人跑了两个样，其余的是pcr的结果） [ Last edited by zhang8826857 on 2012-4-5 at 09:37 ] |
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xinshen0915
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西瓜: 金币+5 2012-04-05 18:51:41
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你做个阳性对照试一下吧，看是不是体系中有问题，找个你确定能扩出来的模板和引物，最好这个对照的目的片段扩出来与你的实验组的目的片段大小和退火温度比较相近，如果此阳性对照能扩出来，而你的实验组仍扩不出来，那就证明你的反应体系没问题，那就有可能是你的引物设计有问题，或者是模板有问题。如果连阳性对照都没扩出来，那就把DNA聚合酶,dNTP, ddH2O换了试一下，做PCR最好作对照，不然结果不好解释，正负对照都要做，负对照就是把所有的成分除了模板都加，看体系是否有污染。实验都难免会遇到问题，不要灰心，祝你好运~ |
16楼2012-04-05 16:58:45
2楼2012-04-05 09:44:35
3楼2012-04-05 09:52:49
xinshen0915
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【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 应助指数+1, 很认同，考虑梯度很有道理的啊 2012-04-05 11:39:18
zhang8826857: 金币+5, ★有帮助 2012-04-05 15:51:34
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zhang8826857: 金币+5, ★有帮助 2012-04-05 15:51:34
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下面的条带应该是引物二聚体，上面的条带很有可能是质粒模板，在做PCR之前要先检测质粒的浓度，一般以质粒为模板做PCR扩增是应该先稀释模板的。问题可以考虑从几个方面解决： 1、确保你的反应体系没有问题，看是否有某种成分未加，确保DNA聚合酶,dNTP, ddH2O等都没有问题； 2、换一种DNA聚合酶试一下； 3、看是否是退火温度设置不合理，可以考虑梯度扩增； 4、如果换了聚合酶和退火温度还是扩不出来，就得考虑是不是引物设计不合理了。 |
4楼2012-04-05 10:01:55
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