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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 寻找好心人，帮帮我，关于引物以及PCR的问题！
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)

[求助] 寻找好心人，帮帮我，关于引物以及PCR的问题！

版主以及论坛内的各位高手快快现身吧，小弟实在被折磨的不行了，最近的实验相当不顺，PCR老是扩不出目的基因，不知道问题出在哪儿！5月19就要论文答辩了，过段时间还要去复试，时间太紧了！
RNA提取好之后直接反转录，用内参和设计的引物来PCR，内参可以扩出来，但是设计的引物却没有扩出条带，退火温度我用55度和50度都试了，但还是没有条带！现在感觉可能是我的引物有问题，但引物是老师帮我设计的，我也不知道是哪个模板！
现在我的问题就是：我有引物的合成单，还有一段模板序列，但是不知道这个引物是不是以那个模板设计出来的，有没有什么办法可以检测下我的引物和模板能不能配对上啊，primer5.0可以吗？还望各位告知！
引物：S1-4 GGCTCCCGCAAGTTAT
           A1 CCACCCACCCATACACT
           A2 CCACGCTTCACCCTACC
           A3 ACTGTCTGCCCACTCAC
           A4 GAGCACCGTTCCATACC
我说的模板序列为：CCACTTTTTTTTCCCCTTTCGCATCGCAATTGCGGNCNTGTCTTGCGTGTTCGCTGGCTGCACAAATTCTTCCCTCTCCGCGCGCCCCTAGAGAAAGCCGGCTCCCGCAAGTTATTAGGGAGTTGGTGTTACCGCCCGGGGGCCGACTGCAATGTTCTGTGTTGATCTGTCTCCCTCATCTTTTATAGTGGTGGCCCGCCGCGATGTTTGCTGATCACAGCCGGGATGCTGTTGGGGAGACTGAAAAGGAGGGAGAGTCGTCAAGCTAGGGGCATCCAAGAGAGGCAGCCTAACTTAGAGTTGCACGGTTCTGTGCGTGAGTGTATGGGTGGGTGGCTCGGTGGAGATACGCGCAGCAGCGGCGCGGGGAGGGGGGGGGAGGGGAAGCGAAGAGGCGGGGGCGGGTCGTGTGGATCGTTCAATGGGCATTAGCGCAGCGCAACTGGATACAATAGGAGGGCCGCGCTCTGTGGCAGGGGGGGGTGGGAGGCGAGCGGAGCGTGACACGTACAGGCTCTCCTAGGGTCGGCCAGCATCTGGGTGTGGGGCAGGAGCCTGGCAGTGAGTGGGCAGACAGTCGAGGTAGGGTGAAGCGTGGAGGCGAAGAAAAGGATGGGGCAAGCTGTATAAATGAACACGAGCGGCTAGGAAGTGGTGGGGAGTAGGTGTGTGGGGGTGTAGAGGGTGGGGAGAAAAAAAATTGGATTAGACGTGCGCACAATCCCGACGGTATGGAACGGTGCTCAGCGCG
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1楼 2012-03-09 20:44:07
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苏拉的世界

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木(金币+3, MolEPI+1): 很有用 2012-03-14 11:14:24
"我有引物的合成单，还有一段模板序列，但是不知道这个引物是不是以那个模板设计出来的，有没有什么办法可以检测下我的引物和模板能不能配对上啊，primer5.0可以吗？还望各位告知！"关于楼主的这个问题你可以使用DNAMAN来解决自己找一下就是了，关于PCR扩增不出来你可以设置温度梯度从42到55不等，另外你也可以在前面加一个37度循环，另外呢，你可以用DNAMAN看一下你的引物，配对多吗，看一下是不是特别容易形成二聚体，根据这个你再做调整
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关关雎鸠，在河之洲
3楼2012-03-14 09:10:15
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dorecnu

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xuzhu598(金币+20): ★★★★★最佳答案 2012-03-14 20:28:50
西瓜(金币+3, MolEPI+1): 很热心哈 2012-03-14 22:19:24
不要急，我慢慢回答你的问题：
1.模板长度为：751bp
2.S1-4 GGCTCCCGCAAGTTAT 位于模板正链100-115bp区段(16bp)；tm47℃
   A1 CCACCCACCCATACACT位于模板互补链320-336区段（17bp）49.7℃
   A2 CCACGCTTCACCCTACC位于模板互补链582-598区段(17bp) tm51.7℃
   A3 ACTGTCTGCCCACTCAC位于模板互补链562-578(17bp)50℃
   A4 GAGCACCGTTCCATACC位于模板互补链729-745(17bp)49.4℃
就是说S1为正向引物F,其余为反向引物R.都能配对上。
3.以S1-4与A1为例，其TM值为47.6与49.7，有cross dimer但是能值很低，因该无影响，建议你降低退火温度至42-45度左右PCR。
4.引物较短，不知道是不是实验设计的特殊要求。
5.以上数据来源于primer 6，vectorNTI 10分析，这些软件就能解决你的问题，要毕业时实验还很忙一定要淡定，认真分析原因。
6.祝实验顺利，早日毕业。
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xuzhu598
4楼2012-03-14 12:16:30
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hlwnxfd2011

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你只摸过55和50吗?你可以做个梯度，换一下酶，现在你的内参出来了，模板肯定没问题，剩下只是要考虑引物，Tm值，还有酶。我的想法可能不成熟，仅供参考。
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2楼2012-03-13 19:08:03
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麻花13

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
尝试一下touch down PCR
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5楼2012-03-14 15:30:41
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)
送鲜花一朵
引用回帖:
楼: Originally posted by dorecnu at 2012-03-14 12:16:30:
不要急，我慢慢回答你的问题：
1.模板长度为：751bp
2.S1-4 GGCTCCCGCAAGTTAT 位于模板正链100-115bp区段(16bp)；tm47℃
   A1 CCACCCACCCATACACT位于模板互补链320-336区段（17bp）49.7℃
   A2 CCACGCTTCAC ...

谢谢你了啊，真是大神呀！再次竖起大拇指，谢谢的详细讲解！
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6楼2012-03-14 20:15:57
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by 麻花13 at 2012-03-14 15:30:41:
尝试一下touch down PCR

嗯，谢谢你的帮忙！
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7楼2012-03-14 20:29:36
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xuzhu598

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
楼: Originally posted by hlwnxfd2011 at 2012-03-13 19:08:03:
你只摸过55和50吗?你可以做个梯度，换一下酶，现在你的内参出来了，模板肯定没问题，剩下只是要考虑引物，Tm值，还有酶。我的想法可能不成熟，仅供参考。

嗯，只试过那两个温度，这几天我再试试其他的温度！谢谢
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8楼2012-03-14 20:30:22
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