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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR引物设计问题，求教大神~
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微生物阿呆

铜虫 (初入文坛)

[求助] PCR引物设计问题，求教大神~

本人新手一枚，求教各位大神问题。
我现在想通过一些乳酸菌16S序列设计通用引物，求大神告知。现在的主要问题是：（1）我现在有40个16S序列，保守序列必须是每个碱基都必须一样么？保守序列必须是连续的么？在两个保守序列上分别设计上，下游引物可不可以？1500左右的碱基序列，有好几个保守序列该如何取舍，还是都需要尝试设计引物？（2）引物设计原则中说，上下游引物GC含量不应差距太大，差多少算是大呢？（3）听说引物设计完了还需要跟原序列对比，比较什么？如何比较？
本人纯新手，乱七八糟问了一大堆......如有耐心高手都好好讲讲更是不胜感激......
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1楼 2013-11-26 09:11:20
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Davidzjy

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-11-26 11:57:20
amisking: 回帖置顶 2013-11-26 17:45:14
内容已删除
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2楼2013-11-26 09:48:49
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足下客

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2013-11-26 17:45:18
gyesang: 金币+3, 鼓励交流！ 2013-11-29 13:13:05
不清楚你的研究目的是什么？你设计通用引物的目的是什么？感觉没表述清楚，看完还是不知道什么意思。
普通的PCR引物设计并不难。两条引物的GC含量最好是控制在40%-60%之间，其实也没有那么严格的，不要有太多的错配，和发夹结构就可以。可以用引物设计软件评一下分数，大概了解一下错配和发夹结构的情况。DNA star和Primer 5都可以。
至于你说的引物设计完之后要跟原序列比对，其实还是为了避免错配现象的发生，看看是否有可能扩增出杂带。如果引物跟原序列不只一处可以发生匹配，这种引物做PCR，非常容易扩出杂带，也就是除了你的目的条带，还可能出现好几条你并不需要的条带。
引物设计的退火温度不要设计的太低，我觉得54度到60度之间效果还都不错的。至于一些设计的细节，光说也说不清楚，设计好之后，最好是给师兄师姐看一下，看可否用。如果是新手，完全没有做过，光靠自己摸索，还是挺耽误时间的，其实问一下懂的人，手把手教你一下，很快就学会了。
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4楼2013-11-26 15:56:24
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普通回帖

微生物阿呆

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Davidzjy at 2013-11-26 09:48:49
1 所谓"通用"就是对每个序列都有效 怎么能使用不同的保守序列
碱基配对状况越好 PCR的结果越好 自然是完全相同最好
如果实在找不到 那也尽量不要让mismatch出现在引物两端附近
2 GC含量差距过大会导 ...

感谢您的答案！我所说的不同的保守序列是指在所有的16SDNA对比过程中保守序列并不连续，一小段一小段的，每段的长度大概300bp一下。不是说扩增的片段在500bp左右为宜么，这该怎么办？
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一日夫妻百日恩，百日夫妻似海参；海参没有虾仁贵，虾仁三十五一斤。
3楼2013-11-26 15:39:27
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zhuht1983

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

不要被一些东西蒙蔽了，引物设计就是很简单的选择而已。
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5楼2013-11-29 11:37:45
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iayala

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

首先要问一下，你设计的通用引物是用来做什么用的？我来设计通用引物没有问题，但我必须根据你的目的来选择模板！
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6楼2013-11-29 14:49:17
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)

海纳百川
这个选择通用引物即可 自己设计何必呢
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海纳百川止于至善
7楼2013-11-29 15:06:15
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08406224

新虫 (小有名气)
在保守的地方找引物序列，扩出来的是不保守的片段。跟原序列比较是看看有没有可能扩出来其他的片段，就是看看引物和原序列的其他地方有没有互补。其他就不知道了
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8楼2013-11-30 21:27:55
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微生物阿呆

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 足下客 at 2013-11-26 15:56:24
不清楚你的研究目的是什么？你设计通用引物的目的是什么？感觉没表述清楚，看完还是不知道什么意思。
普通的PCR引物设计并不难。两条引物的GC含量最好是控制在40%-60%之间，其实也没有那么严格的，不要有太多的错配 ...

如何设计多序列通用引物，请大神们说的尽可能详细一些，包括序列对比如何选择保守序列啊（必须要一个碱基都不差么？最低容忍程度是什么样子的？）引物如何设计（完全按照软件流程来么？还是有其他的注意事项？）设计完引物如何跟原序列比对（对比时该选择哪种？反向？互补？反向互补？）引物设计软件用primer5.0，谢谢大神们啦！
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一日夫妻百日恩，百日夫妻似海参；海参没有虾仁贵，虾仁三十五一斤。
9楼2013-12-02 10:07:38
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微生物阿呆

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by iayala at 2013-11-29 14:49:17
首先要问一下，你设计的通用引物是用来做什么用的？我来设计通用引物没有问题，但我必须根据你的目的来选择模板！

种属鉴定
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一日夫妻百日恩，百日夫妻似海参；海参没有虾仁贵，虾仁三十五一斤。
10楼2013-12-02 10:08:52
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