应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » QPCR之引物设计(二)
111/2返回列表12下一页
查看: 2973  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR之引物设计(二)

大家好，我做QPCR扩增效率的时候遇到一个基因，之前测得的CT值是30左右，退火温度是54度，溶解曲线如图1。
我现在补做扩增效率，体系试剂什么都是一样的，可是测得的相同样品的CT值基本都在33左右我试过51-57度退火温度，扩增效率很低，连拟合度都不好，CT值比较低，我用的是2倍稀释度，怕是稀释不准，后来重复了几次，但结果依然不是很好。溶解曲线如图2。
大家看这是什么原因呢，感觉引物质量是还好吧？是要换引物吗？

图2.jpg

图1.jpg
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

核酸生物学实验经验

» 本帖@通知

@cicelyzh

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-03-06 16:42:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-08 21:32:43
梯度浓度里有个浓度是以前的浓度，以前CT值是30，现在只有33了，5倍这个浓度的CT值也大于30。...

一般来说，最稀的样品CT不超过33的话问题不是很大。如果CT超过35的话就不好说了。你测的扩增效率有多少？
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2013-03-09 01:16:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+2 2013-03-07 13:15:03
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大，因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度，一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一，特异性是不错的。至于扩增效率，要根据标准样品的CT来计算。
赞一下 回复此楼
2楼2013-03-07 09:48:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+1 2013-03-07 13:15:09
循环数偏大，可以通过稍微调整一下DNA浓度调整。
做扩增效率需要用质粒DNA作模板，如果SLOPE可以，但是扩增效率太低，那就需要换引物。
赞一下 回复此楼
3楼2013-03-07 09:51:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-07 09:48:56
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大，因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度，一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一，特异性是不错的。至于 ...

我做扩增效率是把原浓度模板稀释2倍，做4个梯度，再根据浓度和CT值做的曲线，仪器给出的扩增效率值不高
赞一下 回复此楼
4楼2013-03-07 13:13:24
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-07 09:48:56
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大，因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度，一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一，特异性是不错的。至于 ...

还有哦，我其他基因也是相同的方法，他们的CT值和之前相比就没什么区别的，这是为什么
赞一下 回复此楼
5楼2013-03-07 13:14:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-07 13:14:56
还有哦，我其他基因也是相同的方法，他们的CT值和之前相比就没什么区别的，这是为什么...

做扩增效率的时候CT值是在20-30之间吗？
如果这个基因的CT有变化而其它基因的没什么区别，可能是因为这个基因的结构问题，造成cDNA相对不稳定。这种情况不是很常见。
赞一下 回复此楼
6楼2013-03-08 06:37:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-08 06:37:00
做扩增效率的时候CT值是在20-30之间吗？
如果这个基因的CT有变化而其它基因的没什么区别，可能是因为这个基因的结构问题，造成cDNA相对不稳定。这种情况不是很常见。...

梯度浓度里有个浓度是以前的浓度，以前CT值是30，现在只有33了，5倍这个浓度的CT值也大于30。
赞一下 回复此楼
7楼2013-03-08 21:32:43
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-09 01:16:52
一般来说，最稀的样品CT不超过33的话问题不是很大。如果CT超过35的话就不好说了。你测的扩增效率有多少？...

最好的一次退火温度是62%，但是拟合度只有0.896，后来我模板有重新稀释还换了一个但是还是不好。
赞一下 回复此楼
9楼2013-03-09 09:13:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
shiliyusly: 金币+3 2013-03-09 15:00:31
shiliyusly: 金币+2, 2 2013-03-12 21:40:18
引用回帖:
9楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-09 09:13:37
最好的一次退火温度是62%，但是拟合度只有0.896，后来我模板有重新稀释还换了一个但是还是不好。...

差不多有90%，应该能凑合着用。实在不喜欢就换引物试试。
赞一下 回复此楼

» 本帖已获得的红花（最新10朵）

shiliyusly
10楼2013-03-09 11:09:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 shiliyusly 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭