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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » QPCR之引物设计(二)
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR之引物设计(二)

大家好，我做QPCR扩增效率的时候遇到一个基因，之前测得的CT值是30左右，退火温度是54度，溶解曲线如图1。
我现在补做扩增效率，体系试剂什么都是一样的，可是测得的相同样品的CT值基本都在33左右我试过51-57度退火温度，扩增效率很低，连拟合度都不好，CT值比较低，我用的是2倍稀释度，怕是稀释不准，后来重复了几次，但结果依然不是很好。溶解曲线如图2。
大家看这是什么原因呢，感觉引物质量是还好吧？是要换引物吗？

图2.jpg

图1.jpg
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1楼 2013-03-06 16:42:43
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-08 21:32:43
梯度浓度里有个浓度是以前的浓度，以前CT值是30，现在只有33了，5倍这个浓度的CT值也大于30。...

一般来说，最稀的样品CT不超过33的话问题不是很大。如果CT超过35的话就不好说了。你测的扩增效率有多少？
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8楼2013-03-09 01:16:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+2 2013-03-07 13:15:03
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大，因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度，一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一，特异性是不错的。至于扩增效率，要根据标准样品的CT来计算。
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2楼2013-03-07 09:48:56
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
shiliyusly: 金币+1 2013-03-07 13:15:09
循环数偏大，可以通过稍微调整一下DNA浓度调整。
做扩增效率需要用质粒DNA作模板，如果SLOPE可以，但是扩增效率太低，那就需要换引物。
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3楼2013-03-07 09:51:33
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-07 09:48:56
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大，因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度，一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一，特异性是不错的。至于 ...

我做扩增效率是把原浓度模板稀释2倍，做4个梯度，再根据浓度和CT值做的曲线，仪器给出的扩增效率值不高
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4楼2013-03-07 13:13:24
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-07 09:48:56
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大，因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度，一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一，特异性是不错的。至于 ...

还有哦，我其他基因也是相同的方法，他们的CT值和之前相比就没什么区别的，这是为什么
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5楼2013-03-07 13:14:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
5楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-07 13:14:56
还有哦，我其他基因也是相同的方法，他们的CT值和之前相比就没什么区别的，这是为什么...

做扩增效率的时候CT值是在20-30之间吗？
如果这个基因的CT有变化而其它基因的没什么区别，可能是因为这个基因的结构问题，造成cDNA相对不稳定。这种情况不是很常见。
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6楼2013-03-08 06:37:00
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-08 06:37:00
做扩增效率的时候CT值是在20-30之间吗？
如果这个基因的CT有变化而其它基因的没什么区别，可能是因为这个基因的结构问题，造成cDNA相对不稳定。这种情况不是很常见。...

梯度浓度里有个浓度是以前的浓度，以前CT值是30，现在只有33了，5倍这个浓度的CT值也大于30。
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7楼2013-03-08 21:32:43
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shiliyusly

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-09 01:16:52
一般来说，最稀的样品CT不超过33的话问题不是很大。如果CT超过35的话就不好说了。你测的扩增效率有多少？...

最好的一次退火温度是62%，但是拟合度只有0.896，后来我模板有重新稀释还换了一个但是还是不好。
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9楼2013-03-09 09:13:37
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
shiliyusly: 金币+3 2013-03-09 15:00:31
shiliyusly: 金币+2, 2 2013-03-12 21:40:18
引用回帖:
9楼: Originally posted by shiliyusly at 2013-03-09 09:13:37
最好的一次退火温度是62%，但是拟合度只有0.896，后来我模板有重新稀释还换了一个但是还是不好。...

差不多有90%，应该能凑合着用。实在不喜欢就换引物试试。
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shiliyusly
10楼2013-03-09 11:09:28
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