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shiliyusly

新虫 (小有名气)

[求助] QPCR之引物设计(二)

大家好,我做QPCR扩增效率的时候遇到一个基因,之前测得的CT值是30左右,退火温度是54度,溶解曲线如图1。
我现在补做扩增效率,体系试剂什么都是一样的,可是测得的相同样品的CT值基本都在33左右我试过51-57度退火温度,扩增效率很低,连拟合度都不好,CT值比较低,我用的是2倍稀释度,怕是稀释不准,后来重复了几次,但结果依然不是很好。溶解曲线如图2。
大家看这是什么原因呢,感觉引物质量是还好吧?是要换引物吗?

图2.jpg

图1.jpg
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-07 09:48:56
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大,因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度,一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一,特异性是不错的。至于 ...

我做扩增效率是把原浓度模板稀释2倍,做4个梯度,再根据浓度和CT值做的曲线,仪器给出的扩增效率值不高
4楼2013-03-07 13:13:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

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★ ★
感谢参与,应助指数 +1
shiliyusly: 金币+2 2013-03-07 13:15:03
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大,因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度,一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一,特异性是不错的。至于扩增效率,要根据标准样品的CT来计算。
2楼2013-03-07 09:48:56
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chenguestc

木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
shiliyusly: 金币+1 2013-03-07 13:15:09
循环数偏大,可以通过稍微调整一下DNA浓度调整。
做扩增效率需要用质粒DNA作模板,如果SLOPE可以,但是扩增效率太低,那就需要换引物。
3楼2013-03-07 09:51:33
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shiliyusly

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-03-07 09:48:56
同一cDNA经过冻化CT值会有一点变大。如果做相对定量的话问题不是很大,因为内参的CT也会变大。至于你说的温度梯度,一般是考虑在不同退火温度下的特异性和扩增效率。你的熔解曲线说明产物单一,特异性是不错的。至于 ...

还有哦,我其他基因也是相同的方法,他们的CT值和之前相比就没什么区别的,这是为什么
5楼2013-03-07 13:14:56
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